Purification des peptides : une technique basée sur la RP-HPLC pour extraire des peptides à partir de lysats de protéines digérées

Résumé

Source : Cheng, L. C. et al. Enrichissement en phosphopeptide couplé à une spectrométrie de masse quantitative sans marquage pour étudier le phosphoprotéome dans le cancer de la prostate. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la chromatographie liquide haute performance en phase inverse pour purifier les peptides d’un mélange de lysat de protéines digérées. Ces peptides purifiés sont ensuite lyophilisés et stockés pour des applications en aval. L’analyse des peptides peut aider à comprendre les mécanismes impliqués dans la signalisation cellulaire et le cancer.

Protocole

1. Extraction en phase inverse

1. Commencez par un lysat de protéines prédigéré dans un flacon en verre. Filtrez l’échantillon à l’aide d’un filtre de coupure de 15 mL et de 10 kDa. Centrifuger l’échantillon à 3 500 x g à l’aide du rotor à godet pivotant (ou 3 500 x g dans un rotor à angle fixe) à 15 °C jusqu’à ce que le volume de rétentat soit inférieur à 250 μL (cela prend environ 45 à 60 min). Récupérez le flux et jetez le rétentat.
   NOTE : L’expérience peut être interrompue ici. Congelez les échantillons à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
2. Pour acidifier l’échantillon, ajoutez environ 20 μL d’acide trifluoroacétique (AGT) à 5 % par mL de lysat. Mélangez-les bien et mesurez le pH de l’échantillon à l’aide de bandelettes de pH. Ajustez le pH à 2,5 en utilisant 5 % d’AGF.
3. Connectez l’extrémité la plus courte d’une colonne C-18 à un collecteur à vide. Réglez le vide entre 17 et 34 kPa (ou selon les instructions du fabricant). À l’aide de pipettes en verre, mouillez la colonne avec 3 ml d’acétonitrile à 100 % (ACN). Ne laissez pas la colonne sécher.
4. À l’aide de pipettes en verre, équilibrez la colonne avec 6 mL d’AGF à 0,1 % appliqué sous forme de 2 x 3 mL. Chargez l’échantillon acidifié dans la colonne. N’ajoutez pas plus de 3 ml à la fois. Ajustez le vide pour cibler environ 1 à 2 gouttes par seconde.
5. À l’aide de pipettes en verre, laver la colonne avec 9 mL de TFA à 0,1 % appliqué en 3 x 3 mL. Éluer la colonne avec 2 mL de 40 % d’ACN, 0,1 % d’AFT. Prélever deux fractions de 2 mL dans des tubes de culture en verre. Ignorez la colonne.
6. Couvrez les tubes d’éluat avec du parafilm et percez 3 à 5 trous sur le couvercle à l’aide d’une aiguille 20G. Congelez l’éluat sur de la glace sèche pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce qu’il se solidifie complètement.
7. Lyophilisez les fractions pendant la nuit. Le lendemain, assurez-vous que les échantillons sont complètement secs avant d’arrêter le lyophilisateur. Conservez les tubes dans un tube conique de 50 mL avec des lingettes délicates à -80 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Congélateur à ultra-basse température	Panasonic	MDF-U76V
Congélateur -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Godet à rotor pivotant	ThermoFisher Scientific	75004377
Collecteur à vide	Restek	Référence 26080
Lyophilisateur	Labconco	7420020
Concentrateur de vide de paillasse CentriVap	Labconco	7810010
Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Rotateur bout à bout	ThermoFisher Scientific	Réf. 415110Q
Tubes de culture en verre	Fisher Scientific	Tél. : 14-961-26
Parafilm	Fisher Scientific	Référence 13-374-12
Aiguille 20G	Bd	B305175
Lingettes Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Bouchon à vis cryotube	ThermoFisher Scientific	379189
Nunc 15 mL tubes coniques	ThermoFisher Scientific	Tél. : 12-565-268
Tubes Eppendorf à faible liaison aux protéines	Eppendorf	22431081
Seringue de 3 mL	Bd	309657
Acide trifluoracétique (TFA)	Fisher Scientific	Référence : PI-28904
Acétonitrile (ACN)	Fisher Scientific	Réf. A21-1
Eau MilliQ			Eau déminéralisée utilisée pour préparer toutes les solutions et tampons