Enrichissement en phosphopeptides : une technique d’immunoprécipitation à base d’anticorps pour séparer des peptides phosphorylés spécifiques de mélanges complexes de peptides

Résumé

Source : Cheng, L. C., et al. Enrichissement en phosphopeptide couplé à la spectrométrie de masse quantitative sans marquage pour étudier le phosphoprotéome dans le cancer de la prostate. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, nous démontrons l’immunoprécipitation par anticorps des phosphopeptides à partir d’un mélange de peptides. Les phosphopeptides enrichis sont concentrés sous vide et stockés pour l’analyse en aval.

Protocole

1. Immunoprécipitation et enrichissement des peptides pY

1. Remettre en suspension la poudre lyophilisée de digestions peptidiques purifiées avec 0,5 mL de tampon de liaison par immunoprécipitation (IP) glacé dans chaque fraction. Regroupez les fractions en transférant le volume de remise en suspension de 0,5 mL de la deuxième fraction à la première fraction et conservez la pointe de la pipette. Agiter vigoureusement le vortex (au lieu de pipeter de haut en bas) pour s’assurer que l’échantillon est complètement dissous avant de le transférer dans un cryotube à bouchon à vis de 3,6 ml.
2. Rincer les tubes de lyophilisation avec 0,5 mL de tampon de liaison IP (tableau 1) dans chaque tube. Transférez la solution dans le tube à bouchon à vis de 3,6 ml à l’aide de la même pointe de pipette pour minimiser la perte d’échantillon. Répétez le rinçage 1 fois plus, ce qui porte le volume final de remise en suspension de 2 mL (pour 5 mg de protéines). Mesurez le pH de l’échantillon pour vous assurer qu’il est d’environ 7,4. S’il est trop acide, ajoutez itérativement 10 μL de 1M Tris (non titré, pH ~11). S’il est trop basique, ajoutez de manière itérative 10 μL de HCl dilué (1:25 ou 1:100).
3. Prélaver les billes de pY (pour 5 mg de lysat de départ)
   1. 25 μg d’anticorps 4G10 et 12,5 μg d’anticorps 27B10.4 sont nécessaires par échantillon. Après avoir utilisé une pipette p200 avec une pointe coupée pour transférer les anticorps dans des tubes de microcentrifugation séparés, lavez les anticorps avec 450 μL de tampon de liaison IP glacé 2x. Centrifugez-les à 100 x g pendant 1 min à 4 °C et aspirez le surnageant.
   2. Remettre les billes en suspension à une concentration de base de 0,5 mg/mL à l’aide d’un tampon de liaison IP. (Ne faites pas vortex les perles.) Après avoir aliquoté la suspension nécessaire (50 μL de suspension d’anticorps 4G10 et 25 μL de suspension d’anticorps 27B10.4 par échantillon) dans un seul tube, faire tourner les tubes de centrifugation d’origine à 200 x g pendant 1 min à 4 °C. Lavez les parois latérales avec du surnageant avant de ranger les billes au réfrigérateur.
4. Ajoutez des billes de pY prélavées à la solution d’échantillon remise en suspension dans les cryotubes à bouchon à vis. Incuber à 4 °C sur un rotateur bout à bout pendant la nuit.
5. Placez les cryotubes à bouchon à vis dans un tube à centrifuger de 50 ml tapissé d’une lingette délicate. Faites tourner les perles à 100 x g pendant 1 min. Conservez le surnageant, qui sera utilisé pour enrichir les peptides pST.
6. Remettez les billes en suspension avec 300 μL de tampon de liaison IP. Transférez-les dans un tube de microcentrifugation de 2 ml et faites-les tourner à 100 x g pendant 1 min à 4 °C.
7. Rincer le tube d’incubation 3 fois avec 200 μL de tampon de liaison IP. Transférez le contenu dans le même tube de microcentrifugation à chaque fois. Ensuite, faites-les tourner.
8. Lavez les billes dans le tube de microcentrifugation 3 fois avec 500 μL de tampon de liaison IP et faites-les tourner à 100 x g pendant 1 min. Ensuite, lavez les billes 4 fois avec 450 μL de 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,5, et essorez-les à 100 x g pendant 1 min. Utilisez à chaque fois une solution fraîche de 25 mM de NH₄HCO₃ à partir de poudre.
9. Centrifugez les billes à 1 500 x g pendant 1 min. À l’aide d’une pointe de chargement de gel, éliminez complètement le surnageant en plongeant l’extrémité de l’embout de chargement de gel légèrement sous la surface des billes.
10. Ajouter 4 fois le volume de billes de 0,1 % de TFA aux billes (c.-à-d. ajouter 300 μL de TFA à 0,1 % pour 75 μg de suspension de billes de pesant). Mélangez-les bien et incubez le mélange dans un thermomixeur à 1 000 tr/min pendant 15 min à 37 °C.
11. Transférez la remise en suspension dans un filtre d’essorage de 0,2 μm. Faites tourner rapidement le tube d’élution et transférez le volume résiduel dans le même filtre de spin à l’aide d’une pipette P10. Faites tourner le filtre d’essorage à 850 x g pendant 1 min. Transférez l’élution dans un tube de microcentrifugation à faible liaison protéique. Concentrez l’éluat sous vide pour qu’il soit sec pendant la nuit à 40 °C et avec un temps de chaleur de 300 min.
    note: L’expérience peut être interrompue ici. Congelez les échantillons à -80 °C et continuez à une date ultérieure.

Tableau 1 : Tampons et solutions.Ce tableau montre la composition des tampons et des solutions utilisés dans ce protocole.

tampon	volume	composition
6 M de tampon de lyse au chlorure de guanidinium	50 ml	6 M de chlorure de guanidinium, 100 mM de tris pH 8,5, 10 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine, 40 mM de chloroacétamide, 2 mM d’orthovanadate de sodium, 2,5 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM de β-glycérophosphate, 500 mg de n-octyl-glycoside, eau ultra-pure au volume
100 mM de pyrophosphate de sodium	50 ml	2,23 g de pyrophosphate de sodium décahydraté, eau ultra-pure au volume
1M β-glycérophosphate	50 ml	15,31 g de β-glycérophosphate, eau ultra-pure au volume
5 % d’acide trifluoroacétique	20 mL	Ajouter 1 mL d’acide trifluoroacétique à 100 % dans 19 mL d’eau ultra-pure
0,1 % d’acide trifluoroacétique	250 ml	Ajouter 5 ml d’acide trifluoroacétique à 5 % à 245 ml d’eau ultra-pure
Tampon d’élution pY	250 ml	0,1 % d’acide trifluoroacétique, 40 % d’acétonitrile, eau ultra-pure au volume
Tampon d’élution pST	250 ml	0,1 % d’acide trifluoroacétique, 50 % d’acétonitrile, eau ultra-pure au volume
Tampon de liaison IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM chlorure de sodium, eau ultra-pure au volume
25 mM de bicarbonate d’ammonium, pH 7,5	10 ml	Dissoudre 19,7 mg dans 10 mL d’eau stérile ultra-pure, pH à 7,5 avec de l’acide chlorhydrique 1 N (~10-15 μL/10 ml de solution), faire fraiser
Tampon phosphate 1M, pH 7	1 000 ml	423 mL de dihydrogénophosphate de sodium 1 M, 577 mL d’hydrogénophosphate de sodium 1 M
Tampon d’équilibrage	14 ml	6,3 ml d’acétonitrile, 280 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 1740 μL d’acide lactique, 5,68 ml d’eau ultra-pure
Tampon de rinçage	20 mL	9 mL d’acétonitrile, 400 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 10,6 mL d’eau ultra-pure
Solution de spectrométrie de masse	10 ml	500 μL d’acétonitrile, 200 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 9,3 mL d’eau ultra-pure
Zone tampon A	250 ml	5 mM de phosphate monopotassique (pH 2,65), 30 % d’acétonitrile, 5 mM de chlorure de potassium, eau ultra-pure au volume
Tampon B	250 ml	5 mM de phosphate monopotassique (pH 2,65), 30 % d’acétonitrile, 350 mM de chlorure de potassium, eau ultra-pure au volume
0,9 % hydroxyde d’ammonium	10 ml	300 μL d’hydroxyde d’ammonium à 29,42 %, 9,7 mL d’eau ultra-pure

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lyophilisateur	Labconco	7420020
Concentrateur de vide de paillasse CentriVap	Labconco	7810010
Lingettes Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Filtre de spin Millipore 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubes Eppendorf à faible liaison aux protéines	Eppendorf	22431081
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone : 4G10	Millipore Sigma	Référence 16101
Anticorps 27B10.4	Cytosquelette	Perles APY03
Kit de dosage peptidique	Thermo Scientific	Référence 23275
Astuce	PolyLC Inc	TT200TIO,96
Colonnes SCX (PolySULFOETHYL A)	PolyLC Inc	SPESE1203
Seringue de 3 mL	Bd	309657
Eau MilliQ			Eau déminéralisée utilisée pour préparer toutes les solutions et tampons
Acide trifluoracétique (TFA)	Fisher Scientific	Référence : PI-28904
Acétonitrile (ACN)	Fisher Scientific	Réf. A21-1
chlorure de potassium	Fisher Scientific	BP366-500
Acide lactique	Sigma-Aldrich	Référence 69785-250ML
Hydroxyde d’ammonium	Fisher Scientific	A669S-500
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-5