Enrichissement de phosphopeptides à base de dioxyde de titane : une méthode d’isolement sélectif de phosphopeptides à partir d’une bibliothèque de peptides

Abstract

Source : Cheng, L. C. et al. Enrichissement en phosphopeptide couplé à une spectrométrie de masse quantitative sans marquage pour étudier le phosphoprotéome dans le cancer de la prostate. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’enrichissement en phosphopeptides extraits de tissus tumoraux de la prostate à base de dioxyde de titane. Ces phosphopeptides enrichis peuvent être utilisés pour des applications en aval telles que la caractérisation des protéines afin de comprendre les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la progression du cancer de la prostate.

Protocol

1. Enrichissement en dioxyde de titane des peptides pY

1. Remettre en suspension les phosphopeptides séchés dans 200 μL de 50 % d’ACN, 0,1 % d’AGF. Vortex et centrifugez-les à 10 000 x g pendant 30 s. Répétez cette opération 1 fois pour bien les remettre en suspension.
2. Préparation des billes de TiO₂ contenues dans des pointes d’une capacité de 200 μL d’échantillons.
   1. Tapotez doucement sur le petit côté de la pointe pour déplacer le matériau à cette extrémité. Rincez l’embout en ajoutant 200 μL d’ACN à 100 %, puis retournez l’embout et effleurez la petite extrémité pour déplacer le liquide vers le bouchon.
   2. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la petite extrémité de la pointe et placez-la sur un tube à faible teneur en protéines. (Évitez d’utiliser des tubes en polystyrène car le TiO₂ collera aux côtés du tube.) Retirez le capuchon et insérez une micropipette pour plonger l’ACN restant. Répétez le lavage avec 200 μL de 100 % d’ACN. Les billes de TiO₂ sont maintenant situées dans le tube à faible liaison protéique pour les étapes suivantes.
   3. Préconditionnez TiO₂ avec 500 μL de 100 % ACN 2x. Pipetez-le pour mélanger les billes avec le solvant. Centrifugez-les à 100 x g pendant 1 min.
   4. Condition TiO₂ avec 500 μL de tampon de phosphate de sodium 0,2 M (pH ~7) 2x. Laver les billes avec 300 μL de tampon d’équilibrage 3x. Parce que le TiO₂ est très dense, les billes vont se déposer rapidement.
3. Ajouter 400 μL de 50 % d’ACN, 0,1 % d’AGZ dans le tube à faible liaison aux protéines, puis ajouter 84 μL d’acide lactique. Transférez les phosphopeptides remis en suspension dans le tube à faible liaison aux protéines et incuberez-les pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un rotateur bout à bout.
4. Centrifugez les billes à 100 x g pendant 1 min pour les granuler. Lavez-les avec 300 μL de tampon d’équilibrage (Tableau 1) 2 fois et essorez-les à 100 x g pendant 1 min.
5. Rincez les billes avec 300 μL de tampon de rinçage 2x. Transférez-les dans un filtre d’essorage de 0,2 μm. Faites-les tourner à 1 500 x g pendant 1 min.
6. Transférez l’unité de filtration dans un tube propre de 1,5 ml à faible teneur en protéines. Éluer le contenu 2 fois avec 200 μL de 0,9 % de NH₃ dans H₂O. Mesurer le pH avec des bandelettes de pH, qui doit être compris entre 10 et 11. Concentrez sous vide l’éluat pour qu’il sèche pendant la nuit afin d’évaporer l’ammoniac.

Tableau 1 : Tampons et solutions.Ce tableau montre la composition des tampons et des solutions utilisés dans ce protocole.

tampon	volume	composition
6 M tampon de lyse au chlorure de guanidinium	50 ml	6 M de chlorure de guanidinium, 100 mM de tris pH 8,5, 10 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine, 40 mM de chloroacétamide, 2 mM d’orthovanadate de sodium, 2,5 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM de β-glycérophosphate, 500 mg de n-octyl-glycoside, eau ultra-pure au volume
100 mM de pyrophosphate de sodium	50 ml	2,23 g de pyrophosphate de sodium décahydraté, eau ultra-pure au volume
1M β-glycérophosphate	50 ml	15,31 g de β-glycérophosphate, eau ultra-pure au volume
5 % d’acide trifluoroacétique	20 mL	Ajouter 1 mL d’acide trifluoroacétique à 100 % dans 19 mL d’eau ultra-pure
0,1 % d’acide trifluoroacétique	250 ml	Ajouter 5 ml d’acide trifluoroacétique à 5 % à 245 ml d’eau ultra-pure
Tampon d’élution pY	250 ml	0,1 % d’acide trifluoroacétique, 40 % d’acétonitrile, eau ultra-pure au volume
Tampon d’élution pST	250 ml	0,1 % d’acide trifluoroacétique, 50 % d’acétonitrile, eau ultra-pure au volume
Tampon de liaison IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM chlorure de sodium, eau ultra-pure au volume
25 mM de bicarbonate d’ammonium, pH 7,5	10 ml	Dissoudre 19,7 mg dans 10 mL d’eau stérile ultra-pure, pH à 7,5 avec de l’acide chlorhydrique 1 N (~10-15 μL/10 ml de solution), faire fraiser
Tampon phosphate 1M, pH 7	1 000 ml	423 mL de dihydrogénophosphate de sodium 1 M, 577 mL d’hydrogénophosphate de sodium 1 M
Tampon d’équilibrage	14 ml	6,3 ml d’acétonitrile, 280 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 1740 μL d’acide lactique, 5,68 ml d’eau ultra-pure
Tampon de rinçage	20 mL	9 mL d’acétonitrile, 400 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 10,6 mL d’eau ultra-pure
Solution de spectrométrie de masse	10 ml	500 μL d’acétonitrile, 200 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 9,3 mL d’eau ultra-pure
Zone tampon A	250 ml	5 mM de phosphate monopotassique (pH 2,65), 30 % d’acétonitrile, 5 mM de chlorure de potassium, eau ultra-pure au volume
Tampon B	250 ml	5 mM de phosphate monopotassique (pH 2,65), 30 % d’acétonitrile, 350 mM de chlorure de potassium, eau ultra-pure au volume
Hydroxyde d’ammonium à 0,9 %	10 ml	300 μL d’hydroxyde d’ammonium à 29,42 %, 9,7 mL d’eau ultra-pure

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collecteur à vide	Restek	Référence 26080
Lyophilisateur	Labconco	7420020
Concentrateur de vide de paillasse CentriVap	Labconco	7810010
Rotateur bout à bout	ThermoFisher Scientific	Réf. 415110Q
lame	Fisher Scientific	620177
Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Nunc 15 mL tubes coniques	ThermoFisher Scientific	Tél. : 12-565-268
Filtre de spin Millipore 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubes Eppendorf à faible liaison aux protéines	Eppendorf	22431081
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone : 4G10	Millipore Sigma	Référence 16101
Kit de dosage peptidique	Thermo Scientific	Référence 23275
Acide trifluoracétique (TFA)	Fisher Scientific	Référence : PI-28904
Acétonitrile (ACN)	Fisher Scientific	Réf. A21-1
Acide lactique	Sigma-Aldrich	Référence 69785-250ML
Hydroxyde d’ammonium	Fisher Scientific	A669S-500
Phosphate de potassium monobasique	Fisher Scientific	BP362-500
chlorure de potassium	Fisher Scientific	BP366-500
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Scientific	BP510-500
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-5
MonoTip	PolyLC Inc	TT200TIO,96