Modélisation du cancer de la prostate dans des modèles murins génétiquement modifiés : une technique d’édition de gènes localisée médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules du lobe antérieur de la prostate de souris

Résumé

Source : Riedel, M. et al. L’administration virale de CRISPR guide la prostate murine pour l’altération des gènes. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit une méthode de modification de gènes spécifiques dans les cellules de la prostate à l’aide d’un système d’administration basé sur l’adénovirus. L’approche permet une altération orthotopique et localisée de l’expression génique à l’aide de la technologie CRISPR pour développer de nouveaux modèles murins pour le cancer de la prostate.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Transmission du virus à la prostate murine

1. Anesthésier l’animal par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL et d’une aiguille de 27 G x 1/2 po. Utilisez une dose d’anesthésie de 0,01 mL/g de poids corporel. Si l’intervention dure plus de 30 min, maintenez l’anesthésie en injectant 1/3 de la dose initiale toutes les 30 min.
2. Examinez la profondeur de l’anesthésique en évaluant la relaxation musculaire, le retrait de la pédale et les réflexes palpébraux. Lorsqu’une perte de réflexes est observée, rasez le bas-ventre de l’animal.
3. Couvrez soigneusement les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique vétérinaire à l'aide d'un coton-tige stérile pour prévenir la cécité due à l'absence de réflexe cornéen.
4. Essuyez l’abdomen rasé avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée à 10 % pour désinfecter la zone chirurgicale. Frottez la zone chirurgicale du centre de la zone chirurgicale vers la périphérie.
5. Effectuez une incision cutanée verticale au niveau de la ligne médiane basse abdominale d’environ 1 cm à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles.
6. Soulevez le péritoine à l’aide d’une pince à pointe fine pour éviter d’endommager les organes qui se trouvent en dessous. Faites soigneusement une incision de <8 mm à l’aide de ciseaux chirurgicaux à travers le péritoine.
   REMARQUE : Contrairement aux humains, la prostate d'un rongeur comprend quatre lobes distincts. Le lobe antérieur est attaché à la vésicule séminale.
7. Écartez doucement le tissu adipeux pour découvrir la vésicule séminale. À l’aide d’une pince à anneau, soulevez délicatement la vésicule séminale jusqu’à ce que la prostate antérieure puisse être identifiée (Figure 1).
8. Injecter un volume total de 30 μL de solution de virus (3 x 10¹⁰ particules virales) dans l’épithélium antérieur de la prostate à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 mL avec une aiguille de 30 G x 8 mm. Minimisez les fuites et assurez-vous que le liquide est absorbé dans le tissu, formant une petite bulle. Replacez la vésicule séminale dans la cavité abdominale.
9. Suturez le péritoine avec 2-3 points de suture interrompus simples à l’aide de 6-0 sutures résorbables avec un cercle de 13 mm, 3/8 et une aiguille à pointe effilée.
10. Agrafez la peau à l’aide de trois clips stériles de 4,8 x 6,5 mm, en soulevant la peau à l’aide d’une pince pour éviter d’endommager le péritoine.
11. Pour une meilleure récupération, appliquez l’antidote anesthésique à une dose de 0,01 mL/g de poids corporel par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL et d’une aiguille de 27 G x 1/2 po. Remettez soigneusement l’animal dans sa cage.

Résultats

Figure 1 : Illustration de la procédure. La procédure est réalisée chez la souris Rosa26-LSL-Cas9-EGFP générée par Platt et al. La prostate antérieure (PA) est attachée à la vésicule séminale (SV). Des particules virales exprimant l’ARN guide et une protéine Cre sont injectées dans la prostate antérieure pour modifier l’expression des gènes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J souris	Le Laboratoire Jackson	Référence 26175
Seringue à insuline U-100 de 0,5 ml	Bd	324825	pour injection de virus
Seringue de 1 ml	Bd	300013	pour injection d’anesthésie
Aiguille 30 G 1/2''	Bd	Référence 304000	pour injection d’anesthésie
6-0 Suture Polysorb	Medtronic	GL889	pour fermer le péritoine
Champ opératoire stérilisé jetable	plusieurs fournisseurs
Coussin chauffant	plusieurs fournisseurs
Tampon de préparation à la povidone et à l’iode	Fisher Scientific	Tél. : 06-669-70
Machine à tailler	Aesculap	GT415	pour se raser l’abdomen
Pince Dumont	F.S.T	Référence 11252-00
Halsey Micro Porte-Aiguille	F.S.T	Référence 12500-12
Ciseaux à iris	F.S.T	Référence 14094-11
Pince à motif étroit	F.S.T	Référence 11002-12
Pince à anneau	F.S.T	Référence 11106-09
Poignée système de clip de plaie incl. Clips	F.S.T	Référence 12030-01	pour fermer la peau
Dissolvant de système de clip de plaie	F.S.T	Référence 12030-04
1x PBS	Gibco	Référence 10010-023
Antiberline			obtenus de l’animalerie
Butorphanol			obtenus de l’animalerie
Médétomidinechlorhydrate			obtenus de l’animalerie
Le midazolam			obtenus de l’animalerie
100 % éthanol	Fisher Scientific	Référence 22-032-103
Pommade oculaire	Takeda	Référence 7242
Virus (AAV, AV)	plusieurs fournisseurs		virus utilisé dans ce protocole est une production interne