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1. Traitement au bisulfite
- Utilisez 45 μL de la solution de tissu digéré comme échantillon.
- Effectuez le traitement au bisulfite à l’aide des réactifs d’un kit de conversion au bisulfite selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter 5 μL de tampon de dilution à l’échantillon d’ADN et incuber à 37 °C pendant 15 min (voir le tableau des matériaux).
- Pendant l’incubation des échantillons, préparer le réactif de conversion au bisulfite en ajoutant 750 μL de dH2O et 210 μL de tampon de dilution dans un tube de réactif de conversion CT (voir le tableau des matériaux). Mélanger les tubes en tourbillonnant pendant 10 min.
- Après l’incubation de 15 minutes, ajouter 100 μL du réactif de conversion CT préparé à chaque échantillon et mélanger par inversion.
- Incuber les échantillons dans l’obscurité à 50 °C pendant 12 à 16 h.
- Après l’incubation, prélever les échantillons et les placer sur de la glace pendant 10 min.
- Ajouter 400 μL de tampon de liaison et mélanger chaque échantillon en le pipetant de haut en bas (voir le tableau des matériaux). Chargez chaque échantillon dans une colonne de centrifugation et placez la colonne dans un tube de prélèvement de 2 ml (voir la table des matériaux).
- Centrifugez chaque échantillon à pleine vitesse (10 000 x g) pendant 1 min et jetez le flux.
- Ajouter 200 μL de tampon de lavage dans chaque colonne et essorer à pleine vitesse pendant 1 min, en jetant le flux continu (voir le tableau des matériaux).
- Ajoutez 200 μL de tampon de désulfonation dans chaque colonne et laissez la colonne reposer à température ambiante pendant 15 min (voir le tableau des matériaux). Après l’incubation, faites tourner les colonnes à pleine vitesse pendant 1 min et jetez le flux.
- Ajouter 200 μL de tampon de lavage dans chaque colonne et essorer à pleine vitesse pendant 1 min (voir le tableau des matériaux).
- Répétez cette étape une fois de plus.
- Ajouter 46 μL de dH2O dans chaque colonne et placer chaque colonne dans un nouveau tube stérile en polypropylène à usage unique de 1,5 mL (voir le Tableau des matériaux). Faites tourner chaque tube pendant 2 minutes pour éluer l’ADN.
- Retirez chaque colonne d’essorage du tube en polypropylène à usage unique et jetez-la (voir le tableau des matériaux). L’ADN est maintenant prêt pour l’analyse.
2. PCR quantitative spécifique à la méthylation (qMSP)
- Utilisez l’ADN modifié au bisulfite de l’étape 1.3 comme modèle pour la PCR en temps réel basée sur la fluorescence dans qMSP afin d’évaluer la méthylation de la région promotrice dans chaque analyse génique.
- Effectuez une qMSP à l’aide d’un instrument de PCR en temps réel à 96 puits (voir le tableau des matériaux).
- Vérifiez l’état de méthylation du promoteur du gène cible sur l’ADN modifié au bisulfite à l’aide d’une amorce directe de 200 nM, d’une amorce inverse de 200 nM et de sondes de 80 nM. Préparez le mélange maître avec 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM de Tris pH 8,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10 nM de fluorescéine, 0,166 mM de chaque désoxynucléotide triphosphate et 0,04 U/μl d’ADN polymérase (voir le tableau des matériaux). Le volume final de réaction dans chaque puits pour tous les essais est de 25 μL.
- Effectuez les cycles de qMSP comme suit : 95 °C pendant 5 min, suivis de 55 cycles de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 1 min
REMARQUE : Le gène cible doit être choisi en fonction des critères suivants : avoir des valeurs bêta plus élevées, être apparenté à des îlots CpG dans la région promotrice et convenir à la conception d’amorces et de sondes pour la qMSP.
- Utiliser la génomique humaine traitée avec la méthylase CpG (M.SssI) comme contrôle de méthylation positif (voir le tableau des matériaux).
note: La quantification finale de la méthylation est définie comme la valeur de méthylation relative (RMV) et calculée comme suit : 2-ΔΔCt pour chaque réplicat de détection de méthylation par rapport à la moyenne Ct pour la β-actine (ACTB). Les séquences d’amorce et de sonde sont présentées dans le tableau 1. Un Ct de 100 est utilisé pour les réplicats non détectés, ce qui donne une valeur de 2–ΔΔCt proche de zéro. La formule suivante est utilisée :
moyenne 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
| gène | Vers l'avant 5' - 3' | Marche arrière 5' - 3' | sonde |
| B-ACTINE | ÉTIQUETTE GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA CAA ACA ACA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA, AAA, ATC, CCG, ACG, AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |