La cryoconservation par vitrification : une technique de refroidissement ultra-rapide pour conserver les spécimens biologiques à très basse température en vue d’un stockage à long terme

Résumé

Source : Lu, J. H. et al. Établissement de modèles de xénogreffes dérivées de patients atteints de cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’une méthode de cryovitrification ultra-rapide pour la conservation d’échantillons biologiques. Le procédé implique l’utilisation d’une combinaison de cryoprotecteurs pour protéger les tissus biologiques des dommages causés par le gel en empêchant la formation de cristaux de glace intracellulaires.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Cryoconservation des tissus

REMARQUE : Cette partie fait principalement référence aux méthodes du kit cryogénique du kit de tissus vivants. Les principaux kits et équipements sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Euthanasier les souris avec une méthode approuvée par l’IRB lorsque la tumeur a un diamètre supérieur à 10 mm.
2. À l’aide de pinces et de ciseaux stériles, isolez lentement la tumeur des souris.
3. Lavez les tissus tumoraux avec du DPBS dans une boîte de 10 cm. Disséquez et enlevez les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et le tissu conjonctif à l’aide d’une pince et de ciseaux.
4. Coupez les tissus tumoraux à une épaisseur maximale de 1 mm avec un moule.
5. Lavez les tranches avec du DPBS dans un plat de 10 cm.
   note: Le processus de vitrification implique l’utilisation de tubes étiquetés V1/V2/V3 aux étapes 1.6-1.8. Les principaux ingrédients sont le DMSO et le saccharose.
6. Transférez les tranches dans le tube V1 à l’aide d’une pince et incubez le tube à 4 °C pendant 4 min. Roulez et retournez brièvement le tube, puis placez-le à 4 °C pendant encore 4 min.
7. Versez la solution V1 et les tranches dans un plat de 10 cm. Transférez les tranches dans le tube V2 à l’aide d’une pince et incubez le tube V2 à 4 °C pendant 4 min. Roulez et retournez brièvement le tube et placez-le à 4 °C pendant encore 4 min.
8. Versez la solution V2 et les tranches dans un plat de 10 cm. Transférez les tranches dans le tube V3 à l’aide d’une pince et incubez le tube à 4 °C pendant 5 min. Roulez et retournez brièvement le tube, puis placez-le à 4 °C pendant au moins 5 min. Assurez-vous que les tranches coulent toutes au fond du tube.
   1. Si plusieurs tranches restent flottantes, roulez et retournez brièvement le tube, puis replacez le tube à 4 °C jusqu’à ce que toutes les tranches coulent complètement ; si nécessaire, jetez les tranches flottantes.
9. Versez la solution V3 et les tranches dans un plat de 10 cm.
10. Coupez les porte-mouchoirs à la bonne longueur et placez-les sur de la gaze stérile. Transférez les tranches sur les supports. Enveloppez les supports avec la gaze et placez-les dans de l’azote liquide à l’aide d’une pince, puis laissez incuber pendant 5 min.
11. Étiquetez les flacons cryogéniques avec les informations sur les tissus.
12. Transférez les supports contenant des tranches de tissu dans des flacons cryogéniques, qui sont stockés dans de l’azote liquide.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de tissus vivants Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, Chine	Réf. LT2601
Moules et lames auxiliaires traités en tissu	Celliver Biotechnology, Shanghai, Chine	Réf. LT2603
Le	Basalmedia Technology, Shanghai, Chine	L40601