Isolement péritonéal des neutrophiles de basse densité : une technique pour obtenir des neutrophiles de basse densité à partir d’un liquide de lavage péritonéal à l’aide du tri cellulaire activé magnétique

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Isolement de la LDN à partir de lavages de cavité abdominale

1. Acquisition d’échantillons
   1. Perfuser 1 000 ml de solution saline stérile normale directement dans la cavité abdominale avant la fermeture de la plaie chez les patients qui ont subi une chirurgie abdominale en raison d’une tumeur maligne gastro-intestinale.
      note: Des échantillons ont été prélevés chez des patients ayant subi une gastrectomie, une colectomie ou une œsophagectomie sans biais basé sur l’âge ou le sexe. La solution saline a été transférée dans un récipient et versée dans tout l’abdomen en une minute. Ceci est couramment effectué comme un lavage péritonéal postopératoire sans effets significatifs sur les patients.
   2. Laver abondamment la cavité abdominale pendant au moins 1 min
      note: Il est recommandé de remuer lentement le liquide infusé avec les mains du chirurgien afin que les échantillons soient uniformes.
   3. Récupérez 200 ml de liquide de lavage à l’aide de quatre seringues de 50 ml.
      note: Parfois, un connecteur en caoutchouc est utilisé pour absorber les fluides.
2. Effectuer la purification de la LDN péritonéale à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques des granulocytes, CD66b
   note: Étant donné que la couche intermédiaire après centrifugation par gradient de densité contient de nombreuses cellules mononucléaires, une sélection positive de neutrophiles polymorphes à l’aide d’anticorps monoclonaux CD66b a été effectuée.
   1. Transférez le liquide de lavage péritonéal dans un tube de 50 mL.
      note: Dans cette étape, passez les fluides à travers un filtre en nylon de 100 μm pour éliminer les impuretés.
   2. Centrifuger le liquide péritonéal à 270 x g pendant 7 min à RT.
   3. Remettre les granulés en suspension dans 5 mL de PBS avec 0,02 % d’EDTA.
   4. Superposer soigneusement les 5 mL de suspension cellulaire sur une solution de gradient de densité de 3 mL.
   5. Centrifugeuse à 1 700 x g pendant 15 min à RT sans aucune pause.
   6. Récoltez environ 2 à 3 ml d’une solution contenant les couches intermédiaires (figure 1A) à l’aide d’une pipette et mélangez-la avec 10 ml de PBS contenant 0,02 % d’EDTA.
   7. Centrifuger le liquide péritonéal à 400 x g pendant 7 min à RT et jeter le surnageant.
   8. Ajouter 10 mL supplémentaires de PBS avec 0,02 % d’EDTA et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à RT. Jeter le surnageant.
   9. Dissoudre la pastille de cellule (1 x 10⁷) dans 60 μL de tampon pour le kit de séparation magnétique des cellules.
   10. Ajouter 20 μL de bloc Fc aux granulés et incuber pendant 10 min à 4 °C.
   11. Ajouter 20 μL d’anti-CD66b conjugué à des microbilles et incuber pendant 10 min supplémentaires à 4 °C.
   12. Lavez et remettez en suspension les granulés dans 500 μL de tampon MACS.
   13. Appliquez la suspension de cellule sur une colonne magnétique dans le champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié et collectez le flux contenant des cellules CD66b(-) en lavant la colonne avec 15 mL de tampon.
   14. Retirez la colonne du séparateur magnétique et rincez immédiatement les cellules CD66b(+) marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
       note: La population de cellules CD66b(+) est principalement constituée de neutrophiles, comme déterminé par l’analyse FACS, indiquant que >95 % de la fraction CD66(+) est positive pour CD11b, CD15 et CD16, mais négative pour CD14.

Figure 1 : Formation de TNE après la culture de LDN péritonéale. (A)Après centrifugation par gradient de densité du liquide de lavage postopératoire, les cellules récupérées de la couche intermédiaire sont montrées. (B) Ensuite, les CD66b(+) LDN ont été séparées des cellules mononucléées CD66b(-) et cultivées sur des plaques à 6 puits recouvertes de poly-L-lysine, suivies d’un ajout de colorant nucléaire et d’une observation immédiate par microscopie à fluorescence. (C) Le même nombre de cellules mononucléées CD66b(-) a été cultivé dans les mêmes conditions. (D) La monocouche de LDN a été incubée avec de la DNase I pendant 5 minutes avant la coloration nucléaire. (E) Les CD66b(+) LDN ont été cultivés sur des plaques de plastique sans revêtement. Les barres blanches représentent 100 μm. Cette figure a été modifiée par rapport à une publication précédente.