1. Coloration des cellules tumorales avec un colorant de liaison de cellules fluorescentes rouges
- Préparez les lignées cellulaires cancéreuses humaines MKN45, NUGC et OCUM-1.
- Laver 1 x 107 cellules avec du PBS + 0,02 % d’EDTA dans un tube de 15 mL et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à RT.
- Ajouter 1 mL de solution pour coloration aux pastilles et pipeter doucement.
- Dissoudre 4 μL de colorant Red Fluorescent Cell Linker dans 1 mL de solution pour coloration et mélanger avec la suspension cellulaire de l’étape 1.2.
- Incuber les granulés pendant 4 min à RT.
- Ajouter 4 ml de DMEM (10 % FBS) pour arrêter la réaction de coloration.
- Centrifuger 270 x g pendant 7 min et jeter le surnageant.
- Répétez deux fois les étapes 1.6 et 1.7.
- Vérifiez au microscope à fluorescence (excitation = 551 nm, émission = 567 nm) que les cellules tumorales sont colorées en rouge.
2. Analyse de l’adhésion des cellules tumorales aux TNE
- Cultiver des cellules neutrophiles de faible densité dans une plaque enrobée de poly-L-lysine à 6 puits (6 cm de diamètre) pendant 2 h à 37 °C dans 5 % de CO2, ce qui permet la production de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE
- Transférez les cellules tumorales colorées par fluorescence rouge (1 x 106) dans 1 mL de RPMI 1640 complété par 0,1 % de BSA.
- Ajoutez les cellules tumorales à la culture de LDN qui a produit les TNE.
- Incuber pendant 5 min à 37 °C, ce qui permet aux cellules tumorales de contacter les TNE.
note: Une longue incubation induit l’adhésion des cellules tumorales à la LDN ou aux plaques.
- Retirez le milieu et lavez délicatement les puits en ajoutant 2 ml de milieu préchauffé (0,1 % BSA + RPMI 1640) et en remuant le plat.
- Répétez deux fois la procédure de lavage à l’étape 2.5.
note: Étant donné que les TNE se fixent faiblement à la plaque, le lavage doit être effectué aussi doucement que possible pour éviter de retirer les TNE elles-mêmes.
- Ajouter un colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes à une concentration finale de 5 μg/mL pour visualiser les TNE.
- Observez les TNE et les cellules tumorales attachées à l’aide des filtres appropriés (vert, excitation = 504 nm, émission = 523 nm ; rouge, excitation = 551 nm, émission = 567 nm).
- Fusionnez les figures pour montrer les cellules tumorales qui sont piégées par les TNE.
note: Dans certaines expériences, l’enzyme de dégradation de l’ADN a été ajoutée à la culture de LDN (concentration finale de 100 U/mL) 5 min avant la co-incubation pendant 5 min.