Microscopie à fluorescence time-lapse des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour analyser l’interaction post-adhésion entre les cellules cancéreuses et les TNE

Résumé

Source : Kanamaru, R. et al. Les pièges extracellulaires à neutrophiles générés par les neutrophiles de faible densité obtenus à partir d’un liquide de lavage péritonéal favorisent la croissance et l’attachement des cellules tumorales. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous analysons le comportement post-adhésion des cellules cancéreuses piégées dans des pièges extracellulaires de neutrophiles (TNE) en co-cultivant des neutrophiles de basse densité et des cellules cancéreuses gastriques. L’analyse vidéo en accéléré permet de surveiller divers événements cellulaires et d’étudier le rôle des TNE dans des conditions pathologiques.

Protocole

1. Analyse vidéo en accéléré des cellules tumorales piégées

1. Cultiver les LDN péritonéales dans une boîte ronde de 35 mm enduite de poly-L-lysine et incuber pendant 2 h à 37 °C dans 5 % de CO₂.
2. Ajoutez le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes afin de visualiser les TNE à la concentration finale de 5 μM.
3. Après 1 min d’incubation, retirer le milieu et ajouter 2 mL de BSA à 0,1 % + RPMI 1640.
4. Retirez le média et ajoutez-y 1 x 10⁶ cellules MKN45 non colorées en suspension dans 0,1 % de BSA + RPMI 1640. Incuber pendant 5 min à RT.
5. Retirez toutes les cellules tumorales non attachées en lavant doucement la boîte en ajoutant 2 ml de milieu préchauffé (0,1 % BSA + RPMI 1640) et en faisant tourner la boîte.
6. Répétez deux fois la procédure de lavage ci-dessus.
   note: Étant donné que les TNE se fixent faiblement à la plaque, le lavage doit être effectué aussi doucement que possible pour éviter de retirer les TNE elles-mêmes.
7. Ajouter du DMEM avec 10 % de FCS complété par 100 u/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
8. Montez la boîte de culture dans un système d’observation cellulaire à vue d’ensemble et sélectionnez le champ approprié dans lequel les cellules tumorales sont piégées par les TNE.
9. Continuez à co-cultiver pendant deux jours supplémentaires et prenez des photos continues du champ toutes les 6 minutes sous une lumière normale et une fluorescence, ce qui détecte les cellules MKN45 et les TNE, respectivement.
10. Superposez les images à chaque point temporel et construisez des vidéos en accéléré à l’aide du logiciel Image Viewer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SYTOX colorant d’acide nucléique vert 5mM solution dans DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	Réf. S7020
RPMI1640 Moyen	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis	R8758
Eagle modifié de Dulbecco à teneur moyenne-élevée en glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis	D5796
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis	D8537
Sérum de veau fœtal, régions qualifiées, approuvées par l’USDA	gibco par life technologies, Mexique	Référence 10437-028
Poudre lyophilisée d’albumine sérique bovine, ≥96 % (électrophorèse sur gel d’agarose)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis	A2153
Pénicilline Streptomycine	Life Technologies Japon	Référence 15140-122
Plasmocine Prophylactique	InvivoGen, San Diego, Californie, États-Unis	Ant-MPP
Stéréomicroscope à fluorescéine	BX8000, Keyence, Osaka Japon	BZ-X710
Système d’observation de cellules à vue d’ensemble	Nikon, Kanagawa, Japon	BioStudio (BS-M10)
Lignée cellulaire du cancer gastrique humain MKN45	Riken, Tukuba Japon	n/a