Préparation de blocs d’exosomes : un protocole pour préserver les exosomes de cellules cancéreuses du côlon humain en culture

Résumé

Source : Jung, M. K. et al. Préparation d’échantillons et imagerie d’exosomes par microscopie électronique à transmission. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit la technique de préparation de blocs d’exosomes à partir de cellules tumorales gastro-intestinales en culture. Ces blocs d’exosomes peuvent ensuite être tranchés, colorés et imagés pour déterminer la position de protéines spécifiques dans la vésicule bicouche lipidique.

Protocole

1. Préparation des blocs d’exosomes

1. Granuler les exosomes du surnageant de culture des cellules HCT116 par centrifugation à 100 000 x g pendant 1,5 h. Retirer le surnageant de culture et fixer soigneusement la pastille d’exosome purifié avec 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % dans une solution de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,0) pendant 1 h à 4 °C. Pour du cacodylate de sodium 0,1 M, dissoudre 4,28 g d’acide cacodylique dans 160 mL d’eau distillée (DW). Ajustez le pH à 7,4 avec 0,1 M HCl, puis augmentez à 200 mL avec de l’eau distillée.
2. Retirez le fixateur et rincez les granules avec 1 ml de tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à température ambiante. Répétez l’opération trois fois, chaque changement durant 10 min.
3. Fixer l’échantillon avec 1 mL de tétroxyde d’osmium à 2 % pendant 1 h à 4 °C.
4. Retirez le fixateur et rincez trois fois avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M toutes les 10 minutes.
5. Incuber pendant 10 min avec une série graduée d’acétone (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, respectivement) sur l’agitateur.
6. Retirez l’acétone et incubez la solution de mélange d’enrobage d’acétone 3:1 à faible viscosité pendant 30 min. La pastille d’exosome se trouve dans le tube.
7. Retirez le milieu et ajoutez 1:1 acétone :faible viscosité enrobant le milieu de mélange, puis incubez pendant 30 min.
8. Retirez le milieu et ajoutez du milieu de mélange d’enrobage 1:3 acétone :faible viscosité, puis incubez pendant 30 min.
9. Retirez le milieu et ajoutez 100 % du mélange d’enrobage à faible viscosité et incubez toute la nuit à température ambiante.
10. Incorporer l’échantillon dans un mélange d’enrobage pur à faible viscosité à l’aide du moule d’enrobage et cuire au four pendant 24 h à 65 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
glutaraldéhyde	Ems	Référence 16200
Cacodylate de sodium	Ems	Référence 12300
Tétroxyde d’osmium 1 g cristal	Ems	19100	Utiliser uniquement dans une hotte
acétone	JUNSEI	N° 1B2031