Immunomarquage à l’or des coupes exosomiques : une technique pour visualiser les marqueurs diagnostiques dans la lumière exosomale

Résumé

Source : Jung, M. K., Mun, J. Y. Préparation d’échantillons et imagerie d’exosomes par microscopie électronique à transmission. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’immunocoloration à l’or de biomarqueurs localisés dans la région de la lumière de coupes exosomiques ultraminces. Cette technique permet un diagnostic précoce des maladies par visualisation des molécules cibles dans les exosomes sécrétés par les cellules malades.

Protocole

1. Immuno-coloration de coupes d’exosomes et imagerie

1. Préparez des coupes ultraminces de 60 nm d’un bloc d’exosomes à l’aide d’un ultra-microtome et collectez-les sur une grille de nickel.
2. Incuber les grilles dans des gouttes de 50 μL de glycine 0,02 M pendant 10 min pour tremper les groupes aldéhydes libres.
3. Rincer dans 100 μL de DW trois fois chacune pendant 10 min. Incuber à température ambiante pendant 1 h dans du PBS contenant 1 % de BSA.
4. Incuber les grilles dans des gouttes de 50 à 100 μL d’anticorps anti-KRS (1:100 dans du PBS contenant 0,1 % de BSA) pendant 1 h (si nécessaire, cette étape doit être effectuée à 4 °C pendant la nuit.)
5. Lavez les grilles avec cinq gouttes distinctes (50 μL) de PBS contenant 0,1 % de BSA pendant 10 minutes chacune.
6. Transférez les grilles dans des gouttes d’anticorps secondaires pendant 1 h (IgG anti-lapin conjuguées à une particule d’or de 10 nm (1:100) dans du PBS contenant 0,1 % de BSA).
7. Lavez les grilles avec cinq gouttes distinctes (50 μL) de PBS contenant 0,1 % de BSA toutes les 10 min.
8. Colorer deux fois avec de l'acétate d'uranyle à 2 % pendant 20 min dans l'obscurité et avec du citrate de plomb de Reynolds pendant 10 min, respectivement.
9. Observez les grilles sous microscopie électronique à transmission à 80 kV.
10. Cliquez sur « Acquérir », puis sur « Fichier » et « Enregistrer sous » dans le système de caméra CCD sous le TEM à 80 kV. Le temps d’exposition suivait les réglages automatiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétate d’uranyle	Ems	Référence 22400	Produit chimique dangereux
Citrate de plomb	Ems	N° 17900
Microscopie électronique à transmission	Hitachi	N° H7600
Grille en cuivre	Ems	G200-Cu
glycine	sigma	Référence 022K5404
Tampon phosphate salin	sigma	Réf. P4417
Albumine sérique bovine	Aurion	Référence 25557
Anticorps anti-humain CD274 purifié (B7-H1,-L1)	BioLégende	Référence 329710	Mont entier Immumogold
Souris purifiée IgG2b, κ Isotype Ctrl	BioLégende	401202	Monture entière Immumogold (Contrôle)
2ème particule d’or conjuguée 9-11 nm IgG anti-souris	sigma	G7652
paraformaldéhyde	Ems	19210