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Coloration négative d’exosomes purifiés : une procédure pour visualiser la morphologie des exosomes à l’aide de la microscopie électronique à transmission

30 avril 2023

Dans cet article

Résumé

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Source : Jung, M. K. et al. Préparation d’échantillons et imagerie d’exosomes par microscopie électronique à transmission. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit une procédure de coloration négative d’exosomes purifiés. Les exosomes colorés négativement sont imagés à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Cette technique permet de visualiser la morphologie des exosomes.

Protocole

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1. Coloration négative

  1. Déchargez les fines grilles EM en cuivre de 200 mailles recouvertes d’un film de formvar/carbone pendant 1 min à l’aide d’un déchargeur de luminescence.
  2. Fixer les exosomes purifiés avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % pendant 5 min
    REMARQUE : Les vapeurs de paraformaldéhyde sont toxiques. Tous les travaux doivent être effectués dans une hotte ventilée.
  3. Chargez 5-7 μL de solution de suspension d’exosomes sur la grille et incubez pendant 1 min. Si la concentration d’exosome est trop élevée, diluez-la à la moitié à un cinquième.
  4. Colorer immédiatement avec les ~20 gouttes de solution d’acétate d’uranyle (UA) filtrée à 1 % sur la surface de la grille EM à l’aide d’une seringue.
  5. Retirez l’excès de solution UA sur la grille en contactant le bord de la grille avec du papier filtre.
  6. Rincez rapidement la grille avec une goutte d’eau. Cette étape permettra d’éliminer l’excès de solution de coloration.
  7. Placez la grille sur la table en la tenant à l’aide d’une pince à épiler, et couvrez partiellement la grille avec un plat de culture pour sécher pendant 10 min à température ambiante.
  8. Stocker le réseau dans un boîtier de réseau EM pour une observation future par un MET à 80 kV.

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétate d’uranyleEmsRéférence 22400Produit chimique dangereux
Microscopie électronique à transmissionJEOLJEM2200FS
Déchargeur de luminescenceJEOLJFC1100E
paraformaldéhydeEms19210
Formvar Cuivre revêtu de carbone
Grille (200 mesh)		EmsFCF200-CU
Formvar Nickel
revêtu de carbone Grille (200 mesh)		EmsFCF200-NI

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Mots-clés

Purification d exosomescoloration l ac tate d uranylefixation au paraformald hydepr paration de grilles EMtraitement par d charge luminescenteadsorption d exosomess chage des grilles

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