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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Congélation et montage
musculaire
- Immerger la moitié inférieure d’un petit bécher en plastique (50 ml) contenant de l’isopentane dans de l’azote liquide. L’isopentane est prêt à l’emploi lorsqu’il devient légèrement visqueux et forme un stratifié blanc solide qui tapisse l’intérieur du bécher (température : -160 °C).
note: Utilisez toujours des outils à main en bronze ou en aluminium qui ne produisent pas d’étincelles. Évitez de respirer la vapeur du produit. Utiliser avec une ventilation adéquate. S’il est impossible ou peu pratique de faire face à un déversement et que la ventilation est peu pratique, portez un respirateur approprié.
- Congelez un peu de milieu d’enrobage sur un mandrin (bouchon) en le trempant brièvement (10 s) dans de l’isopentane.
- Manipulez le muscle (par exemple, le tibial ou le gastrocnémien) en le tenant par le tendon, verticalement par rapport au liège, afin de maintenir l’orientation des fibres et de permettre des sections transversales.
- Positionnez soigneusement la partie terminale du muscle frais sur le milieu d’enrobage congelé.
note: Le muscle va coller. Il est important de NE PAS entourer complètement le muscle avec un milieu d’encastrement. Il est également important de maintenir l’orientation verticale pour la détermination ultérieure de la section transversale.
- Trempez le mandrin avec le muscle attaché dans le bain d’isopentane (le temps de congélation habituel est de 7 à 15 s, selon la taille et la composition de l’échantillon).
note: L’immersion dans la solution de congélation ne doit pas durer plus longtemps que nécessaire pour congeler complètement l’échantillon. Une congélation trop longue fracturera le bloc tissulaire, tandis qu’un temps trop court provoquera la formation de cristaux de glace. Un spécimen bien congelé sera d’un blanc crayeux.
- Après avoir congelé l’échantillon, placez-le dans un petit sac en plastique ou un tube d’échantillon (50 mL) et rangez-le immédiatement dans un congélateur à -80 °C ou dans de l’azote liquide.
2. Section musculaire
- Réglez la température de fonctionnement de la chambre intérieure du cryostat à environ -23 °C.
- Laissez l’échantillon (préalablement stocké à -80 °C) s’acclimater à la température de travail (quelques heures devraient suffire).
- Coupez plusieurs sections de 8 μm d’épaisseur de l’échantillon (de préférence les muscles tibiaux antérieurs ou gastrocnémiens) et collectez-les sur des lames de verre.
note: Coupez la section au milieu du ventre du muscle. Aussi, par souci de précision, coupez les sections perpendiculairement à l’axe de montage.
- Conservez les lames de verre à l’intérieur de la chambre du cryostat. Ne les laissez pas décongeler si l’objectif est d’effectuer des études IF/IHC ou une coloration enzymatique.
- Conservez les lames à -80 °C pour des analyses plus approfondies.