Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Appareil
- Usinez la partie principale de la base de l’appareil à partir d’un bloc solide de résine acétyle haute densité, comme décrit dans ce manuscrit. À chaque extrémité, créez des bandes surélevées de 3 mm et dépiècez l’usinage de ces rainures de 2,5 mm pour prélever les tiges (voir Figure 1 et Figure 2).
- Fabriquez des tiges à partir d’un acier inoxydable de 2,4 mm de diamètre avec des extrémités arrondies.
note:Le cadre principal du couvercle a été usiné à partir de plaques de Duralumin.
2. Utilisation de l’appareil
- Disséquez l’intestin grêle et le côlon de la cavité abdominale à l’aide de ciseaux et de doigts gantés. Retirez le mésentère en le tenant à l’aide d’une pince incurvée et en le tirant doucement pour l’éloigner de l’intestin.
- Rincer les intestins avec une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) à l’aide d’une pointe de pipette de type Gilson, qui a été coupée à son extrémité la plus large afin qu’elle puisse s’adapter à une seringue en plastique Luer de 10 ou 20 ml.
- Étalez l’intestin grêle (SB) sur une feuille de papier absorbant et divisez-le en trois sections égales de longueur (proximale, médiane et distale – SB1, SB2 et SB3) à l’aide de ciseaux. Retirez le cæcum et disposez le côlon.
- Faites plusieurs très petites incisions dans les segments intestinaux avec des ciseaux pour permettre au liquide de s’échapper et placez une feuille de papier absorbant sur les intestins et passez doucement un doigt sur les préparations pour essorer le liquide et éponger.
- Soulevez les sections et insérez les tiges en acier inoxydable qui ont été préalablement mouillées en trempant dans un bécher de solution saline tamponnée au phosphate.
note: L’intestin peut être inversé si vous le souhaitez (retourné à l’envers).
- Étiquetez un morceau de carton ou de papier filtre coupé à la taille voulue pour s’adapter à la base de l’appareil. Le crayon est le meilleur, car il n’est pas affecté par pratiquement toutes les solutions. La date de l’autopsie, le code expérimental et le numéro d’identification de l’animal sont suggérés.
- Placez la carte ou le papier filtre dans la base de l’appareil. Insérez les tiges et les intestins dans les fentes à la base de l’appareil. Assurez-vous que l’extrémité proximale des segments est positionnée de manière standardisée. Les extrémités proximales doivent être près des étiquettes des cartes.
- Placez la partie supérieure de l’appareil sur la base. Utilisez les barres inclinées pour guider une lame de scalpel afin de couper les sections longitudinalement.
note: Il est utile de tenir doucement et soigneusement le tissu avec un doigt pour s’assurer qu’il ne bouge pas avec le couteau.
- Retirez la partie supérieure de l’appareil. Retirez délicatement le papier filtre et les mouchoirs (toujours sur leurs tiges).
note: Un morceau de carton rigide placé sous le papier filtre facilitera le soulèvement.
- Légèrement mouillés (avec un bout de doigt ganté trempé dans du PBS) les segments. Roulez la tige, d’un côté à l’autre, pour ouvrir l’intestin et l’étaler à plat. Le mouchoir adhérera alors au papier filtre.
- Examinez visuellement les préparations pour détecter toute lésion macroscopique.
- Transférez le tissu collé au papier filtre dans un bain peu profond (ou une boîte à sandwich) contenant un fixateur.
note: Une fois que le tissu adhère au papier filtre ou à la carte, il restera fermement attaché. Une large gamme de fixateurs peut être utilisée pour conserver la préparation. Il est recommandé d’utiliser le liquide de Carnoy pour l’étude de la prolifération cellulaire intestinale, qui est la fixation idéale pour les meilleures méthodes de prolifération cellulaire ; Cependant, le formol ou de nombreux autres fixateurs peuvent également être utilisés si d’autres paramètres sont nécessaires.
- Après fixation (généralement 3 h), transférez les préparations dans de l’éthanol à 70 %. Les échantillons peuvent ensuite être stockés jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Les préparations peuvent être étudiées en face et/ou utilisées pour la préparation d’échantillons histologiques pour l’H&E ou d’autres techniques de coloration histologique, l’immunohistochimie et/ou l’hybridation in situ.
note: Une fixation prolongée peut réduire la réactivité immunohistochimique et/ou la réactivité d’hybridation in situ. Les boîtes à sandwich en polypropylène sont idéales pour stocker un grand nombre de préparations.
- Si nécessaire, les tissus fixés des différents segments intestinaux peuvent être transformés en « rouleaux suisses » et colorés avec toute la gamme des méthodes histologiques, y compris celles décrites ci-dessus. Pour faire un « rouleau suisse », les segments intestinaux sont retirés du papier filtre, enroulés autour d’un bâtonnet à cocktail ou d’un cure-dent, fixés avec une épingle entomologique et traités pour l’enrobage de cire.
- Si nécessaire, colorez le tissu en vrac avec du bleu de méthylène pour visualiser les foyers aberrants de la crypte.
- Marquez à loisir les préparations fixées.