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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des solutions
- Comme décrit dans le tableau 1, préparez le tampon du côlon, le milieu de séparation de densité à base de silice 100 %, le milieu de séparation de densité à base de silice 66 %, le milieu de séparation de densité à base de silice 44 %, le tampon de digestion de la collagénase E et le tampon FACS.
- Préparez le tampon pour le côlon la veille de l’intervention et conservez-le toute la nuit à 4 °C.
- Préparez un milieu de séparation par densité à base de silice à 100 % la veille de l’intervention et conservez-le toute la nuit à 4 °C, en le plaçant à température ambiante le matin de la procédure pour décongeler.
- Préparez un milieu de séparation à base de silice à 66 % et 44 % le matin de l’isolement, en utilisant un milieu de séparation à densité 100 % à base de silice à température ambiante et un tampon pour le côlon.
- Mesurez la quantité appropriée de collagénase E dérivée de Clostridium histolyticum et conservez-la à -20 °C pendant la nuit avant l’intervention. Le lendemain matin, dissoudre dans le volume approprié de tampon de digestion du côlon pour obtenir le tampon de digestion de la collagénase. Pour toutes les incubations avec tampon de digestion de la collagénase le jour de l’intervention, préchauffez les solutions à 37 °C.
- Pour l’ensemble des étapes du protocole, maintenez une centrifugeuse à 20 °C et à une vitesse de rotation de 859 x g, avec les freins inactivés (0 décélération) pour la centrifugation en gradient. Réglez un autre sur 4 °C et une vitesse de rotation de 859 x g, avec la décélération standard, pour les étapes de lavage.
2. Récolte du côlon
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 suivie d’une méthode de confirmation approuvée par l’AALAC.
- Placez la souris en position couchée et vaporisez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de grands ciseaux à tissus, faites une incision médiane verticale et exposez le péritoine intact.
- À l’aide de ciseaux de dissection fines, ouvrez le péritoine. À l’aide d’une pince, déplacez l’intestin grêle d’un côté et exposez le côlon descendant. Tirez légèrement vers le haut sur le côlon descendant pour exposer au maximum la partie rectale du côlon. Coupez le rectum distal profondément dans le bassin et disséquez et retirez tout le côlon en une seule unité, du rectum distal à la coiffe cæcale.
- Transférez le côlon dans un tampon pour côlon réfrigéré de 20 ml dans un tube en polypropylène de 50 ml.
3. Nettoyage du côlon
- Placez le côlon sur une serviette en papier humidifiée et extrayez les selles solides en appliquant une légère pression sur la paroi intestinale avec l’extrémité émoussée des ciseaux ou des pinces.
- Placez le côlon dans une boîte de Pétri et rincez l’intestin avec 10 ml de tampon pour côlon réfrigéré à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille de remplissage émoussée de 18 G.
- Transférez le côlon dans une serviette en papier humidifiée dans un tampon à côlon et retirez le mésentère et la graisse avec l’extrémité pointue des ciseaux.
- Placez le côlon dans une boîte de Pétri remplie de 5 à 10 ml de tampon pour côlon réfrigéré, en agitant manuellement pour laver le reste du contenu du côlon. Répétez 2 à 3 fois.
- Coupez le côlon longitudinalement de son extrémité rectale plus musclée au côlon proximal (générant un seul morceau de côlon ouvert rectangulaire) dans une boîte de Pétri remplie de tampon de côlon frais et réfrigéré. Jetez le support existant et remplissez-le avec un tampon Colon propre et réfrigéré.
- Lavez l’intestin 3 fois en le faisant tourner vigoureusement dans la boîte de Pétri et en remplaçant les 5 à 10 ml de tampon pour côlon réfrigéré après chaque lavage.
- Placez le tissu rectangulaire du côlon sur une serviette en papier imbibée de tampon à côlon et coupez-le en le coupant horizontalement puis en petits fragments (sections de 3 mm x 3 mm).
- Prélevez soigneusement les fragments du côlon à l’aide d’une pince fine dans un tampon de côlon réfrigéré de 20 ml dans un tube conique en polypropylène de 50 ml.
- Lavez les fragments du côlon trois fois, chaque lavage dans un tampon pour côlon de 20 ml, en remuant vigoureusement le tube pendant 30 s. Entre chaque agitation, laissez les fragments de tissu se déposer au fond du tube. Décanter ou aspirer sous vide le surnageant tout en empêchant la perte de fragments de tissu dans le processus d’aspiration entre chaque lavage.
note: Il n’est pas nécessaire de changer le tube après chaque lavage.
4. Digestion de la collagénase 1
- Ajouter 20 ml de tampon de digestion de la collagénase aux fragments de côlon lavés dans le tube conique en polypropylène de 50 ml.
- Placez le tube fermé de 50 mL à 37 °C dans un agitateur orbital incubé avec la vitesse de rotation réglée à 2 x g pendant 60 min. Assurez-vous que les fragments de tissu sont en mouvement constant pendant l’agitation ; si nécessaire, augmentez la vitesse de rotation progressivement pour vous assurer qu’aucun fragment de tissu ne se dépose au fond du tube.
5. Préparer des gradients de milieux de séparation à base de silice
- Préparez un milieu de séparation de densité à 66 % et 44 % de silice, en utilisant un milieu de séparation de densité à 100 % à base de silice à 20 °C (température ambiante) et un tampon pour le côlon.
- Versez 5 ml de média de séparation de densité à base de silice à 66 % dans chacun des 3 tubes en polypropylène séparés de 15 ml. Préparez trois tubes par côlon. Cela forme la base de densité plus élevée de la procédure d’isolation du gradient, sur laquelle des supports de séparation de faible densité seront superposés pour créer le gradient de séparation.
- Conserver à 20 °C jusqu’à utilisation.
6. Collecte du surnageant de la digestion 1
- Prélever uniquement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL et filtrer le surnageant à travers une crépine à cellules en tissu de filtration à pores de 40 μm placée dans un tube conique en polypropylène propre de 50 mL, une fois la digestion 1 de la collagénase terminée. Attention à ne pas aspirer de fragments de tissus existants.
REMARQUE : Conservez tous les fragments de tissu visibles restants dans le tube. Ceux-ci subiront une seconde digestion de la collagénase (étape 8).
7. Tampon de digestion de la collagénase
- Remplissez complètement le tube en polypropylène de 50 ml avec le tampon à côlons réfrigéré.
note: La collagénase est active à 37 °C ; Par conséquent, le tampon réfrigéré inactive cette enzyme.
- Centrifuger le tube à 4 °C à 800 x g pendant 5 min.
- Éliminer le surnageant par aspiration intra-utérine. Laver les cellules avec 25 mL de tampon côlon frais et centrifuger à 800 x g pendant 5 min.
- Remettez la pastille en suspension dans moins de 1 mL de tampon Colon frais et réfrigéré.
- Placez le tube conique en polypropylène de 50 ml sur de la glace.
8. Digestion de la collagénase 2
- Répétez l’étape 4 (Digestion 1) avec les fragments de tissu restants conservés de l’étape 6.1.
9. Désagrégation tissulaire après digestion 2
- Rincez vigoureusement les fragments de tissu d’avant en arrière entre le tube et une seringue de 10 ml à l’aide d’une aiguille à bout émoussé de 18 G.
- Répétez cette chasse d’eau pendant un minimum de 7 à 8 passages complets, en continuant jusqu’à ce qu’aucun fragment de tissu grossier ou débris ne soit visible.
10. Cellules filtrantes
- Passez la suspension de désagrégation tissulaire à travers une crépine cellulaire en tissu de filtration de 40 μm dans un tube en polypropylène propre de 50 mL.
- Lavez la crépine à cellules du tissu filtrant avec 10 ml de tampon Colon réfrigéré pour récupérer toutes les cellules coincées dans le filtre.
11. Extinction de la digestion de la collagénase
- Remplissez le tube conique en polypropylène de 50 ml jusqu’au bord avec un tampon à côlons réfrigéré.
REMARQUE : La température du tampon du côlon est critique pour assurer la trempe de l’activité de la collagénase.
- Essorage à 4 °C et 800 x g pendant 5 min.
- Éliminer le surnageant par aspiration intra-utérine.
- Laver en remettant en suspension dans 25 mL de tampon Colon frais et réfrigéré, puis par centrifugation à 4 °C, 800 x g pendant 5 min.
- Éliminer le surnageant par aspiration intra-utérine.
- Mettez en pool la pastille de Collagenase Digestion 1 (étape 7) dans son tube correspondant à partir de l’étape 11.4.
- Répétez l’étape 11.4 (lavage et centrifugation).
12. Séparation de densité à base de silice Séparation de gradient de milieu
REMARQUE : Effectuez les étapes 12 et 13 le plus rapidement possible pour assurer une extinction rapide de l’activité de la collagénase.
- Après l’étape 11.7, remettre chaque pastille en suspension dans un total de 24 ml de milieu de séparation par densité à base de silice à 44 % par côlon.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, superposer lentement 8 mL du milieu de l’étape 12.1 sur chacun des trois tubes préparés à l’étape 5.2 (contenant 66 % de média de séparation de la densité à base de silice). Maintenez un écoulement régulier et lent du média de séparation de densité de 44 % tout en superposant le gradient afin d’éviter de perturber l’interface.
- Équilibrez soigneusement tous les tubes à l’intérieur des godets de centrifugation à l’aide d’une balance ou d’une balance.
- Faites tourner les tubes 20 min à 859 x g dans une centrifugeuse sans frein à 20 °C. Laissez les rotors se reposer complètement avant de retirer les tubes, en prenant soin de ne pas perturber les cellules à l’interface de gradient
.
13. Collecter des cellules mononucléaires à partir de l’interface de gradient
- Visualisez l’interface du gradient (près de la marque de 5 ml), où une bande blanche de 1 à 2 mm d’épaisseur (contenant des MNC) est généralement présente.
note: On peut voir ou non une bande blanche. Cependant, MNC sera à cette interface et devrait obscurcir la clarté de l’interface de gradient .
- Aspirez sous vide et jetez les 7 mL supérieurs du dégradé supérieur pour faciliter l’accès de la pipette à l’interface.
- À l’aide d’une aspiration manuelle continue et d’un mouvement de rotation régulier du poignet, collectez la couche d’interface des cellules dans un tube conique en polypropylène propre de 50 ml. Prélever jusqu’à ce que l’interface entre les deux gradients soit claire et réfractile (sans cellules).
- Remplissez le tube de collecte avec 50 ml de tampon FACS réfrigéré. Essorage à 4 °C, 800 x g pendant 5 min.
- Aspirez le surnageant par aspiration intra-utérine et mettez à nouveau la pastille en suspension dans 1 mL de tampon FACS.
- Compter les cellules sur un hémocytomètre à une dilution de 1:2 en utilisant des méthodes d’exclusion des cellules mortes appropriées.
- Procéder à la coloration FACS ou à d’autres dosages avec MNC colique fraîchement isolée.
Table 1 : Table de préparation de la solution
| solution | formule |
| Tampon deux-points | 500 mL de RPMI + 10 mM d’HEPES + 10 % de FBS (inactivé à la chaleur à 56°C pendant 60 minutes, pH ajusté à 7,3) |
| Média à gradient de densité à base de silice 100 % (par deux-points) | 22,5 mL de média à gradient de densité à base de silice + 2,5 mL de 10x PBS. |
| Média à gradient de densité à base de silice 66 % (par deux-points) | 10,72 mL de média à gradient de densité à base de silice 100 % + 5,28 mL de tampon pour le côlon |
| Média à gradient de densité à base de silice 44 % (par côlon) | Média à gradient de densité à base de silice de 11 ml 100 % + tampon pour côlon de 14 ml |
| Tampon de digestion de la collagénase (par côlon) | 100 U/mL de collagénase E de Clostridium histolyticum, dissoute dans 40 mL de tampon pour le côlon |
| Tampon FACS | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g d’azoture de sodium |