Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Établissement d’organoïdes fundiques gastriques 3D d’origine humaine
REMARQUE : Pour éviter toute contamination, effectuez le protocole dans son intégralité à l’intérieur d’une hotte de culture de tissus stérile. Du tissu fundique humain a été prélevé chez des patients subissant une sleeve gastrectomie.
- Prélevez le tissu des patients subissant une gastrectomie en manchon et placez-le dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) glacée sans Ca2+/Mg2+ dans un grand récipient en plastique.
- À l’aide d’une pince, laver vigoureusement le tissu dans un bécher stérile contenant 100 mL de DPBS exempt de Ca2+/Mg2+. Laver pendant environ 30 secondes ou jusqu’à ce que les débris et le sang aient été éliminés. Ensuite, à l’aide d’une gaze stérile, essuyez la couche muqueuse de l’épithélium.
- À l’aide d’une grande pince, saisissez fermement la couche musculaire du tissu et, avec force, grattez l’épithélium à l’aide de la grande pince hémostatique incurvée. Récupérez les fragments épithéliaux grattés dans une boîte de Pétri stérile en polystyrène.
- Émincez le tissu épithélial en fragments d’environ 2,0 x 2,0 mmà l’aide de rasoirs pour optimiser la digestion des tissus. Laver les fragments de tissu avec du DBPS sans Ca2+/Mg2+ complété par des antibiotiques (DPBS sans Ca2+/Mg2+, pénicilline/streptomycine à 1 %, amphotéricine B à 0,25 mg/mL /10 mg/mL de gentamicine, 50 mg/mL de kanamycine), jusqu’à ce que le lavage soit exempt de sang. Effectuez plusieurs lavages si nécessaire. Jetez le linge en le filtrant soigneusement à travers une gaze stérile dans un bécher à déchets.
- Prélever les fragments lavés dans une fiole en verre à fond rond de 125 mL munie d’un barreau d’agitation de 25 mm et d’un milieu d’incubation préchauffé (milieu de base complété par 2 mM de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine, 10 mM de tampon HEPES, 1 mg/mL de collagénase de type 1, 2 mg/mL d’albumine sérique bovine de qualité culture cellulaire). Fermez la fiole à fond rond avec des septa en caoutchouc.
- Insérez une aiguille spinale de 20G dans le septa et connectez-la à une bouteille d’oxygène avec un tuyau en caoutchouc. Pour filtrer tout contaminant, insérez du papier de soie dans le tube pour créer un filtre. Allumez le débit d’oxygène à basse température. Insérez 10 à 15 aiguilles d’écoulement dans les septa pour éviter la rupture des septa.
- Fixez l’ensemble à un support annulaire à l’aide de pinces et placez-le dans un bain-marie calibré à 37 °C avec une plaque d’agitation pendant 30 à 45 min. Après que le tissu a été incubé pendant 15 minutes, prélever 50 μL de milieu d’incubation et vérifier visuellement la présence de glandes dissociées. Si les glandes ne sont pas denses ou ne se sont pas séparées du tissu, laissez agir 5 à 10 minutes supplémentaires.
- Immédiatement après l’incubation, ajouter 50 mL de DMEM/F-12 préchauffé dans le milieu d’incubation à l’aide d’une pipette sérologique stérile ou en le versant directement dans le mélange d’incubation.
- Filtrez le mélange de presse-étoupes à travers une gaze stérile dans quatre tubes coniques de 50 ml. Maintenir le filtrat sur de la glace pendant 15 min pour permettre aux glandes extraites de se déposer au fond du tube conique. Veillez à ne pas déranger les glandes installées ; retirer et jeter les 40 premiers mL de surnageant à l’aide d’une pipette sérologique. Remettre en suspension les 10 ml restants dans 10 ml de DPBS complété par des antibiotiques.
- Répartissez le mélange uniformément dans des tubes à essai de culture cellulaire de 5 ml. Centrifuger pendant 5 min à 65 x g à 4 °C et prélever le surnageant avec précaution à l’aide d’une pipette.
note: Il est crucial d’effectuer cette étape sur la glace et d’éviter la polymérisation de la matrice de la membrane basale lors du mélange. De plus, il est important d’inspecter visuellement la densité des glandes en échantillonnant 50 μL. La densité optimale est de ~70 % de confluence.
- Ensuite, plaquez les glandes dans 50 μL de la matrice de la membrane basale à l’aide d’une pipette à pointe large. Évitez de produire des bulles pendant le placage.
- Pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser, incuber pendant 10 à 15 min à 37 °C. En cas de placage dans une plaque de culture à 12 puits, ajouter 1 mL de milieu hFGO (milieu Eagle modifié Advanced Dulbecco/milieu F-12 complété par 2 mM de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL d'amphotéricine B/10 mg/mL de gentamicine, 50 mg/mL de kanamycine, 10 mM de tampon HEPES, 1 mM de n-acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, Milieu conditionné à 50 % par Wnt, milieu conditionné à 20 % par Spondine R complété par un inhibiteur de la protéine morphogénétique osseuse de 100 ng/mL, une gastrine de 1 nM, un facteur de croissance épidermique de 50 ng/mL, un facteur de croissance des fibroblastes de 200 ng/mL 10, un nicotinamide de 10 mM et un inhibiteur de ROCK Y-27632 de 10 μM. Si vous n’utilisez pas une plaque de culture à 12 puits, ajoutez suffisamment de milieu pour immerger la bulle de matrice de la membrane basale.
- Cultivez les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5 % de CO2. Changez de support tous les 4 à 5 jours.
