$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des instruments, des milieux de culture et des plats
- Autoclave un ensemble de ciseaux intestinaux, de ciseaux normaux et de pinces dans un récipient stérile.
- Placez un plat à 96 puits (à fond plat) dans un incubateur à 37 °C.
- Préparez 10 ml de milieu de culture complet avec les réactifs indiqués dans la table des matières.
- Incuber le milieu complet à 37 °C dans un bain-marie.
- Décongelez la membrane basale reconstituée en la plaçant dans un seau à glace. La membrane basale reconstituée deviendra liquide à 4 °C.
- Remplissez quatre boîtes de Pétri avec une solution saline tamponnée au phosphate froid ou PBS (4 °C).
2. Isolement des cryptes de l’intestin grêle
- Sacrifice par inhalation de CO2 d’une souris Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 sur fond C57BL6/J. Disséquez le péritoine longitudinalement avec une paire de ciseaux.
- Tenez l’estomac avec la pince et coupez-le transversalement en deux.
- À l’aide des ciseaux intestinaux, retirez l’intestin et placez-le dans une boîte de Pétri contenant PBS.
note: Les ciseaux intestinaux ont une pointe pointue et émoussée. La pointe émoussée de ces ciseaux est destinée à ne pas endommager l’architecture crypte-villosité lors de l’ouverture de l’intestin.
- Commencez par placer l’embout émoussé dans l’estomac et poussez-le doucement à travers le pylore. Procédez en coupant avec les ciseaux et en tirant avec la pince.
- Une fois que tout l’intestin grêle est ouvert longitudinalement, lavez-le dans du PBS froid en le tenant avec la pince et rincez-le doucement dans la solution de PBS avec des mouvements en forme de U.
- Une fois que tous les restes de selles sont éliminés, procédez à l’aplatissement de l’intestin sur une planche à découper, côté luminal vers le haut. La face luminale est facilement reconnaissable par l’absence de vaisseaux sanguins et par son aspect pâle par rapport à la partie externe.
- À l’aide d’une lame de verre, retirez délicatement les villosités en grattant l’intestin aplati. Effectuez cette étape deux fois sur toute la longueur du tissu.
- Coupez l’intestin grêle à l’aide d’une lame chirurgicale stérile en morceaux de 2 à 5 mm.
- Placez les fragments de l’intestin grêle dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de PBS glacé.
- Nettoyez les fragments de tissu, en éliminant toutes les impuretés restantes en les pipetant de haut en bas dans le PBS. Jetez le surnageant et répétez cette étape jusqu’à ce que le PBS soit complètement clair.
- Ajouter 15 mL de PBS froid pour porter le volume final total de PBS à 25 mL. Ajouter 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber pendant 45 min sur un rouleau à 4 °C.
- Jetez le PBS/EDTA.
- Ajoutez 10 ml de PBS et détachez les cryptes en pipetant durement les fragments de tissu de haut en bas (au moins trois fois). Récupérez le surnageant.
- Répétez l’étape 2.13 quatre fois. Ajouter le milieu de culture pour obtenir un volume final de 50 mL.
- Granuler les cellules par centrifugation (300 x g pendant 5 min).
- Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de culture et granuler les cryptes par centrifugation (80 x g pendant 3 min).