Extraction d’un rein intact d’une souris : une technique pour obtenir un rein sans capsule rénale à partir de modèles murins

Résumé

Source : Grainger, N. et al. Isolement et imagerie en direct et intact des régions de stimulateur cardiaque du bassinet rénal de souris par section de vibratome. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’extraction rénale de l’espace rétropéritonéal de la souris. Le rein extrait peut ensuite être microdisséqué pour obtenir un rein intact sans capsule rénale et la couche de graisse environnante.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dissection rénale

1. Anesthésier les souris par inhalation de 3 à 4 % d’isoflurane dans une hotte ventilée. Confirmer l’induction de l’anesthésie profonde par perte du réflexe de pincement de l’orteil et/ou de la queue, puis euthanasier les souris par luxation cervicale.
2. Appliquez de l’éthanol à 70 % sur la poitrine pour humidifier la fourrure. À l’aide de ciseaux de dissection externe, ouvrez la cavité abdominale par une incision longitudinale, avec les lames de ciseaux inclinées loin de l’animal pour éviter d’endommager les organes internes.
3. À l’aide d’une pince à tissus internes et de ciseaux de dissection interne, pincez les intestins et retirez-les de la paroi abdominale. Tout en soulevant les intestins, coupez la face inférieure des intestins libres du corps au niveau du duodénum proximal et du côlon distal pour accéder à l’espace rétropéritonéal contenant les reins.
4. Une fois les reins exposés, extrayez-les individuellement. Pincez doucement et soulevez l’extrémité distale de l’uretère (à ~4 mm du rein) avec une pince à tissus. À l’aide des ciseaux de dissection, coupez sous l’uretère pincé vers le rein. Continuez à couper sous le rein jusqu’à ce qu’il soit libéré du tissu conjonctif environnant.
   note: Pour maximiser l’intégrité des tissus et la cohérence de la coupe lors de la section du vibratome, le rein doit être aussi intact que possible. Pour s’en assurer, évitez de pincer ou de couper le rein avec des pinces et des ciseaux de dissection.
5. Placez le rein avec l’uretère attaché dans une solution KRB glacée. Répétez les étapes d'extraction avec le rein controlatéral pour retirer du corps de la souris. Maintenir les reins en solution KRB sur ice.
   REMARQUE : Passez immédiatement à la section suivante du protocole pour préserver la viabilité des tissus PKJ. En raison de sa localisation anatomique profonde dans le parenchyme rénal, la PKJ est privée de contact avec la solution KRB.

2. Préparer le rein sans capsule rénale pour la section du vibratome

1. Transférez le rein dans une boîte de dissection recouverte d’élastomère de silicium (60 mm x 15 mm) et remplissez-le d’une solution KRB glacée jusqu’à ce que le rein soit complètement immergé.
2. À l’aide d’un microscope à dissection, ancrez le rein à la base de la boîte en insérant des broches minutieuses dans l’uretère proximal et à travers la fine capsule rénale antérieure ou le tissu adipeux environnant.
   note: Veillez à ne pas perforer le tissu du parenchyme rénal.
3. Utilisez des ciseaux à ressort fins et des pinces internes pour retirer le tissu adipeux de la base du rein afin d’exposer le RP distal et l’uretère proximal.
4. Retirez l’uretère proximal et une partie du RP distal de la base du RP à l’aide de ciseaux à ressort fins.
   note: Veillez à ne pas couper le parenchyme rénal environnant. La ligne pointillée noire de la figure 1A indique la position approximative de cette coupe. Cette coupe crée une base plate sur le rein pour une section plus uniforme des tissus. Lors de la dissection du rein, il faut être conscient de la position anatomique de la région PKJ. La figure 1B montre que le rein intact peut être coupé le long d’un plan sagittal pour exposer la moelle, la papille (moelle distale où convergent les canaux collecteurs) et la RP proximale et distale. Si la papille devait être complètement exposée, comme sur la figure 1C, la PKJ et la RP proximale (RP prox) peuvent être visualisées. Cependant, cela ne doit pas être fait pour la technique du vibratome ; cette description vise à orienter le lecteur vers l’emplacement général de la PKJ, mis en évidence par la différence anatomique montrée dans les images en lumière transmise de la région PKJ et de la région médio-RP dans la figure 1D, E.
5. Percez la capsule rénale externe avec une pince à pointe fine, en orientant les pointes loin du corps rénal. À l’aide d’une pince avec chaque main, pincez les extrémités libres de la capsule et séparez-les. Continuez à décoller la membrane restante de la capsule rénale jusqu’à ce qu’elle soit entièrement retirée.
   note: La capsule rénale est une couche fibreuse dure qui entoure le rein. Il doit être retiré avant la section du vibratome pour une coupe optimale.

Résultats

Figure 1 : Anatomie de base du rein et localisation de la région du stimulateur cardiaque PKJ.(A) Schéma du rein intact montrant l’orientation du RP et de l’uretère. L’artère rénale et la veine rénale sont affichées en rouge et en bleu, respectivement. (B) Le rein intact peut être coupé le long d’un plan sagittal pour exposer la face interne du rein, y compris...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri de 60 mm x 15 mm	Sigma Aldrich	Réf. P5481	Boîte de dissection pointue pour les reins
Papier absorbant	Fisher Scientific	06-666A	Pour sécher le rein avant l’application colle
B6 ; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Le Laboratoire Jackson	Référence 13148	Souris GCaMP3
B6 ; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Le Laboratoire Jackson	Référence 24105	Souris GCaMP6f
N° B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	Le Laboratoire Jackson	Référence 19079	Souris smMHC-CRE
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	Le Laboratoire Jackson	Référence 13148	Souris PDGFRa-CRE
éthanol	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	Pour la dissection
Ciseaux Bonn extra-fins	Outils scientifiques fins	Référence 14083-08	Utilisé pour les ciseaux de dissection interne
Ciseaux fins	Outils scientifiques fins	Référence 14060-09	Utilisé pour les ciseaux de dissection externes
Pince à pointe fine	Outils scientifiques fins	Référence 11254-20	Utilisé pour la dissection fine du rein
L’isoflurane	Baxter	NDC 1001936060	Pour l’anesthésie
Élastomère de silicium	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
Pince Adson pour étudiant	Outils scientifiques fins	Référence 91106-12	Pour tenir et déplacer doucement le rein
Forceps Dumont pour étudiants	Outils scientifiques fins	Référence 91150-20	Utilisé pour les pinces de dissection interne
Ciseaux à ressort Vannas	Outils scientifiques fins	Référence 15000-03	Pour une dissection nette et un nettoyage de rein isolé