Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparer les solutions
- Préparez 1 L de solution de bicarbonate de Krebs-Ringer (KRB) contenant 120,35 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 15,5 mM de NaHCO3, 1,2 mM de Na2, 4,1,2 mM de MgCl2, 11,5 mM de glucose et 2,5 mM de CaCl2. Le jour de l’utilisation, maintenez la solution KRB sur ice.
note: Le KRB peut être conservé à 4 °C pendant une semaine au maximum et doit être pré-bullé avec un mélange de 97 % d’O2 et de 3 % de CO2 pendant au moins 10 minutes avant d’être utilisé.
2. Section vibratome du rein
- À l’aide d’une pince à bout émoussé, saisissez doucement le rein préparé et retirez-le de la solution glacée de KRB. Placez immédiatement le rein sur du papier absorbant pendant ~2 à 4 s pour éliminer l’excès d’humidité externe. Roulez doucement le rein sur le papier absorbant pour vous assurer que tous les côtés du parenchyme sont secs afin qu’il y ait une adhérence optimale du rein à l’étape du vibratome.
REMARQUE : Comme le bassinet du rein est situé à l’intérieur du rein et donc protégé par le parenchyme externe, cette courte période de séchage ne serait pas préjudiciable à l’intégrité des tissus.
- Appliquez immédiatement une fine couche de colle cyanoacrylate (~1 cm2) à la base de la plaque d’échantillon de vibratome et utilisez une pince à bout émoussé pour placer le rein, côté uretère vers le bas, sur la zone recouverte de colle. Appliquez une légère pression vers le bas sur le haut du rein avec le bord plat de la pince pendant environ 10 à 20 s pour sécher la colle.
note: Pour stabiliser le rein pendant cette procédure, utilisez une paire de pinces supplémentaire pour maintenir le rein droit pendant que la colle sèche. Il est essentiel que le rein adhère à la plaque d’échantillon en position verticale afin que les sections soient coupées droites. Pour vous assurer que le rein a bien adhéré à la plaque d’échantillon, poussez doucement le côté du rein. Si le rein a réussi à adhérer à la plaque, la base du rein doit rester fixée à la plaque.
- Fixez fermement la plaque d’échantillon au fond du bac tampon. Ajustez le niveau de solution KRB de manière à ce que le haut du rein soit complètement immergé. Pendant les étapes de sectionnement, à mesure que la lame du vibratome s’enfonce plus profondément dans le bac tampon, retirez la solution KRB afin que le porte-lame ne soit pas immergé dans la solution.
note: Si la colle n’a pas complètement séché avant de procéder à cette étape, la colle remontera souvent de la base et sur le parenchyme rénal. Cet excès de colle rendra le sectionnement plus variable. Si cela se produit, retirez le rein de l’assiette et procédez à une préparation de rein frais.
- Pour le sectionnement automatique du vibratome, sélectionnez les positions de début et de fin du cycle de coupe de la lame du vibratome. Vérifiez que ces positions sont à ~0,5 à 1 cm du rein pour vous assurer qu’à chaque avancement de la lame, tout le plan du rein est sectionné.
- Préparez une plaque multipuits (24 ou 48 puits) en remplissant les puits avec la solution KRB et placez la plaque sur de la glace.
note: Lorsqu’elles sont générées, les sections individuelles doivent être placées dans des puits séparés pour garder une trace de la profondeur de la section.
- Démarrez le processus de découpe automatique. Lors du premier passage de la lame, assurez-vous que la lame entre en contact avec le haut du rein. Si aucun contact n’est établi, ajustez la position Z de départ de la lame.
- À l’aide d’une pince, prélevez les sections qui sont libérées du rein. Transférez immédiatement les sections dans des puits individuels et notez la profondeur Z des sections pour évaluer l’emplacement approximatif de la PKJ dans les sections rénales.
note: Selon les paramètres de coupe, certaines sections peuvent ne pas être coupées du bloc rénal. Si cela se produit, utilisez soigneusement des ciseaux à ressort fins pour couper des sections du bloc rénal. Les utilisateurs sont également encouragés à visualiser activement les coupes au microscope optique tout en flottant librement dans des puits individuels afin d’assurer des paramètres de coupe et une localisation optimaux des tissus. Les sections contenant la PKJ seront généralement dérivées à ~ 1000-1500 μm du haut du rein.
- Continuez le protocole de sectionnement jusqu’à ce que les régions PKJ deviennent plus apparentes. Reportez-vous à la section des résultats représentatifs pour une description des régions PKJ au fur et à mesure que le sectionnement se poursuit.
- À ce stade, optimisez les paramètres de sectionnement pour vous assurer que les sections sont libérées du bloc rénal uniformément et sont intactes. De plus, assurez-vous que les régions PKJ sont continues et ininterrompues, car les parois PKJ brisées ne permettront pas une imagerie adéquate des cellules à l’intérieur de la paroi en raison de l’effondrement. Si les parois se brisent, diminuez la vitesse de coupe et augmentez l’épaisseur de la section et continuez à observer les sections au microscope optique pour affiner les paramètres de coupe.
- Stocker les sections à 4 °C dans la solution KRB jusqu’au début de l’expérimentation.
