Modèle d’organoïde de tumeur de la vessie : une méthode de transplantation orthotopique d’organoïdes de vessie dans une vessie murine receveuse

Résumé

Source : Kim, Y. et al. Culture, manipulation et transplantation orthotopique d’organoïdes tumoraux de la vessie de souris.J. Vis. Exp.(2020)

Dans cette vidéo, nous décrivons la transplantation orthotopique d’organoïdes tumoraux de vessie en culture dans la vessie murine pour étudier le rôle de l’environnement de l’organe sur le développement des tumeurs.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Sous-culture Organoïdes de tumeurs de la vessie
 

REMARQUE : Le passage des organoïdes tumoraux de la vessie lorsqu’ils atteignent 100 à 150 μm de diamètre est recommandé.

1. Ajouter 500 μL de collagénase/dispase au milieu organoïde dans une plaque à 24 puits avec des organoïdes tumoraux. Pipetez de haut en bas la matrice de la membrane basale et le milieu. Incuber pendant 20 min à 37 °C et récolter les cellules dans un tube de 15 mL.
   note: Examinez au microscope les organoïdes isolés de la matrice de la membrane basale. Si les organoïdes ne sont pas détachés de la matrice de la membrane basale, augmentez le temps d’incubation ou pipetez plus de fois.
2. Ajouter 5 mL de DMEM préchauffé, centrifuger le tube à 400 x g pendant 3 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
3. Remettre la pastille en suspension à l’aide de 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % préchauffé et de 10 μM d’Y-27632. Incuber 5 min dans un bain-marie à 37 °C. Pipetez vigoureusement les cellules de haut en bas et neutralisez la trypsine à l’aide de 5 ml de DMEM avec 10 % de FBS.
4. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 3 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
5. Remettez la pastille en suspension à l’aide de 1 mL de milieu organoïde préchauffé et comptez le nombre de cellules tumorales uniques.

2. Transplantation orthotopique d’organoïde de vessie (Figure 1A)

1. Préparer les organoïdes tumoraux de la vessie pour la transplantation orthotopique
   1. Avant la transplantation, cultivez les organoïdes tumoraux de la vessie pendant 5 à 7 jours, comme décrit ci-dessus.
   2. Ajoutez 500 μL de collagénase/dispase au milieu organoïde dans une plaque à 24 puits avec les organoïdes tumoraux. Pipeter de haut en bas de la membrane basale, de la matrice et du milieu. Incuber pendant 20 min à 37 °C et recueillir les cellules dans un tube de 15 mL.
   3. Ajouter 5 mL de DMEM préchauffé, centrifuger le tube à 400 x g pendant 3 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
   4. Remettez la pastille en suspension avec 1 mL de DMEM et transférez la solution dans une boîte de Pétri de 90 mm.
   5. Au microscope, prélevez les 10 à 100 organoïdes tumoraux à l’aide d’une micropipette P200 et collectez-les dans un microtube sur de la glace.
   6. Centrifugez le tube à 400 x g pendant 3 min à 4 °C et jetez soigneusement le surnageant.
   7. Maintenez la pastille cellulaire sur de la glace jusqu’à ce que les souris soient prêtes pour la chirurgie.
2. Greffe de paroi sous-muqueuse de la vessie
   1. Préparez une souris nue mâle de 8 à 10 semaines (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) au moins 1 semaine avant l’expérience pour lui permettre de s’acclimater à un nouvel environnement. Injecter de l’enrofloxacine (5 mg/kg) par voie sous-cutanée 24 h avant la chirurgie.
   2. Nettoyez la surface du banc avec de l’eau et du savon. Autoclavez les instruments chirurgicaux avant l’intervention chirurgicale et effectuez l’intervention chirurgicale à l’aide d’instruments stériles.
   3. Gardez la seringue à insuline de 29 G, les pointes de pipette et la matrice de la membrane basale sur de la glace. Administrer le kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée avant l’administration de l’anesthésie.
   4. Anesthésier la souris avec 4 % d’isoflurane dans une chambre d’induction. Une fois l’anesthésie générale obtenue, posez la souris en position couchée et maintenez l’anesthésie par l’inhalation au masque de 2 % d’isoflurane vaporisé.
      note: Si le temps d’anesthésie est supérieur à 30 minutes, appliquez une pommade oculaire sur les deux yeux à l’aide d’un coton-tige pour éviter le dessèchement de la cornée.
   5. Appliquez de la povidone iodée avec de la gaze stérile et essuyez-la avec de l’éthanol à 70 %. Répétez l’opération 3 fois avec une nouvelle gaze ou un coton-tige à chaque fois.
   6. Couvrez l’anus et le champ opératoire à l’aide de champs chirurgicaux jetables et stériles.
   7. À l’aide d’un microscope de dissection pour grossir, faites une petite incision transversale (inférieure à 1,5 cm) dans la peau et la paroi musculaire de la ligne médiane inférieure de l’abdomen avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Exposez la vessie de la cavité abdominale et soutenez-la avec des cotons-tiges imbibés de solution saline.
      note: Si la vessie est pleine d’urine, appuyez doucement sur la vessie pour la décompresser légèrement.
   8. Remettre les granules organoïdes en suspension dans 80 μL de milieu organoïde contenant 50 % de matrice de membrane basale à haute concentration (Tableau 1 et Tableau des matériaux).
   9. Injectez la suspension organoïde dans la face antérieure du dôme de la vessie à l’aide de la seringue à insuline de 29 G sous un microscope à dissection.
   10. Fermez la couche interne de la paroi abdominale avec une suture résorbable antibactérienne, puis fermez la couche externe avec une suture en nylon 4-0. Désinfectez le site chirurgical avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %.
   11. Laissez la souris récupérer sous un irradiateur infrarouge 10 à 15 min. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle retrouve sa conscience et sa motilité.
   12. Un jour après l’opération, vérifiez l’état général de la souris et les fuites anastomotiques. Administrer le kétoprofène (5 mg/kg) une fois par jour pendant 3 jours après l’opération et traiter l’enrofloxacine (5 mg/kg) une fois par jour pendant 10 jours après l’opération.
   13. Lorsque le site d’incision est guéri (10 à 14 jours après la chirurgie), retirez les sutures. Surveillez la croissance de la tumeur de la vessie de souris pendant 2 à 3 semaines après l’injection de l’organoïde tumoral.
   14. Si une croissance tumorale de la vessie est observée, euthanasiez la souris en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone et récoltez toute la tumeur de la vessie. Lavez-le à l’aide de DPBS froid (Figure 1B).
   15. Pour analyser l’histologie de la tumeur de la vessie, colorez la section du tissu incrustée en paraffine à l’aide d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) (Figure 1B).

Milieu organoïde de tumeur de la vessie de souris
DMEM/F-12 avancé (moyen de base)	10 mM HEPES (pH 7,4)
10 mM de nicotinamide	0,5x Supplément sans sérum
2 mM de l-alanyl-L-glutamine dipeptide	1 % Pénicilline/Streptomycine
1 mM de N-acétyl-L-cystéine	50 ng/mL de facteur de croissance épidermique murin
1 μM A 83-01

Tableau 1 : Composition du milieu organoïde de la tumeur de la vessie.

Résultats

Figure 1 : Transplantation orthotopique d’organoïdes tumoraux de la vessie.(A) Schéma de principe de la transplantation orthotopique d’organoïdes tumoraux de la vessie sur une souris nue. (B) Images représentatives de vessies et de coupes colorées H&E de souris transplantées orthotopiquement avec des organoïdes tumoraux de la vessie. Les v...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube conique de 15 mL	Spl	Référence 50015
Plaque à 24 puits	Corning	Référence 3526
Seringue à insuline de 29 g 1/2	Shina	B299473538
Tube conique de 50 mL	Spl	Référence 50050
A8301	Tocris	Référence 2939	Concentration de la crosse : 25 mM
Éthanol absolu	Daejung	Référence 4023-2304
Suture résorbable	Henry Schein	Référence 039010
DMEM/F-12 avancé	thermo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (souris nue)	Rivière Charles	194
Collagénase de type I	thermo	17100017	Concentration de la pâte : 20 mg/mL
Collagénase de type II	thermo	17100015	Concentration de la pâte : 20 mg/mL
Colgénase/dispase	sigma	10269638001	Concentration de la pâte : 1 mg/mL
DMEM (média minimum essentiel modifié de Dulbecco)	Gibco	De 11965 à 118
DMSO (Diméthylsulfoxyde)	sigma	D8418
DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco)	Welgene	LB 001-02
Facteur de croissance du matrigel réduit (DFG) Facteur de croissance réduit (DFG)	Corning	Référence 354230	Utilisation pour la culture d’organoïdes en plaque
Matrigel à haute concentration (HC)	Corning	354248	Utilisation pour la transplantation d’organoïdes
Microtube de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
lame
Tampon salin	JW Pharmaceutique
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200072
Tube d’ultracentrifugation	Beckman Coulter	331372
Chlorhydrate de dichlorhydrate Y-27632	Abmole	Référence M1817	Concentration de la matière : 10 mM