Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation des sondes
- Préparez des sondes en alliage de titane-nickel (40 mm de longueur, 0,2 mm de diamètre) recouvertes d’un sorbant en mode mixte de 7 mm. Le nombre de sondes dépend des points temporels ciblés pendant toute la procédure et du nombre de répétitions (3 est recommandé par point temporel).
note: La durée et le type de phase d’extraction peuvent être ajustés en fonction du mode d’étude, de la polarité des métabolites et de la matrice de l’échantillon.
- Préparez un mélange de nettoyage composé de chloroforme :méthanol 2:1 (v/v). Pipeter 1,0 mL de la solution dans chaque flacon en verre de 2,0 mL et placer une sonde, préalablement percée à travers le bouchon, dans chaque flacon.
note: Avant utilisation, nettoyez toutes les sondes pour éliminer les particules contaminantes.
- Placez les flacons sur l’agitateur et réglez la vitesse d’agitation à 1 200 tr/min. Après 45 min, arrêtez l’appareil et rincez les revêtements avec de l’eau de qualité LC-MS.
- Comme les revêtements doivent subir une étape de préconditionnement pour les activer, préparez un mélange de préconditionnement composé de 1:1 méthanol :eau (v/v). Pipeter 1,0 mL de la solution dans chaque flacon en verre de 2,0 mL et placer une sonde, préalablement percée à travers le bouchon, dans chaque flacon.
- Placez les flacons sur l’agitateur vortex et réglez la vitesse d’agitation à 1 200 tr/min.
- Après 60 min, arrêtez l’agitateur et rincez les revêtements avec de l’eau de qualité LC-MS.
- Stérilisez les sondes selon le protocole de stérilisation standard de l’équipement chirurgical.
2. Extraction
- Ouvrez l’emballage stérile juste avant l’échantillonnage pour vous assurer d’un environnement stérile.
- Insérez deux sondes directement dans le cortex rénal pendant 10 minutes à chaque point de temps. Toute la longueur du revêtement doit être recouverte par la matrice tissulaire ; Aucun angle spécifique n’est nécessaire, mais environ 90 degrés sont généralement utilisés.
note: L’ensemble de la procédure médicale suit les protocoles standard d’une institution donnée. Aucune modification concernant l’échantillonnage SPME n’est envisagée. La procédure comprend les six points temporels d’échantillonnage suivants : a) avant la résection rénale, in vivo à partir d’un donneur ; b)–e) après 1 h, 3 h, 5 h, 7 h de perfusion rénale, ex vivo dans la chambre de l’organe ; f) après reperfusion, in vivo chez le receveur.
- Rétractez les sondes en les retirant du tissu, puis rincez les revêtements avec de l’eau de qualité LC-MS pour éliminer le sang restant de la surface du revêtement. Rincer loin du site chirurgical et immédiatement après le retrait des sondes.
3. Transport et stockage
- Placez les sondes dans des flacons séparés et fermez-les.
- Placez les flacons dans une boîte en polystyrène remplie de glace sèche ou d’azote liquide pour le transport.
- Conservez les échantillons dans un congélateur (-80 °C) ou commencez immédiatement l’étape de désorption.
4. Désorption
- Préparez des solutions de désorption composées de 80:20 acétonitrile :eau (v/v) pour l’analyse métabolomique et de 1:1 isopropanol :méthanol (v/v) pour l’analyse lipidomique.
- Pipeter 100 μL de la solution à insérer dans des flacons marqués de 2,0 mL et placer une sonde, préalablement percée à travers le bouchon, dans chaque flacon.
- Placez les flacons sur l’agitateur vortex et réglez la vitesse d’agitation à 1 200 tr/min pendant 120 min.
- Retirez les sondes des flacons. Les extraits obtenus sont maintenant prêts pour l’analyse instrumentale.
5. Analyse LC-MS
- Placer les flacons contenant des extraits dans l’échantillonneur automatique du système LC-MS.
note: La chromatographie liquide (RP, HILIC) couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution et à un analyseur de masse orbitrap a été utilisée pour cette étude. Pour les paramètres d’analyse métabolomique, passez à l’étape 5.2. Pour les paramètres d’analyse lipidomique, passez à l’étape 5.6.
- Utilisez une colonne de pentafluorophényle (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) pour la séparation en phase inverse.
- Réglez le débit à 300 μL/min, et les températures de l’échantillonneur automatique et de la colonne à 4 °C et 25 °C, respectivement.
- Préparez les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : eau : acide formique (99,9 : 0,1, v/v), et phase mobile B : acétonitrile : acide formique (99,9 : 0,1, v/v). Réglez le débit de phase mobile en fonction des paramètres suivants : Début du flux de phase mobile (0-3 min) : 100 % A suivi d’un gradient linéaire jusqu’à 10 % A (3-25 min), se terminant par le flux isocratique de 10 % A jusqu’à 34 min, suivi de 6 min de temps de rééquilibrage de la colonne.
- Pour la séparation HILIC, utilisez une colonne HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Réglez le débit à 400 μL/min.
- Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : tampon acétonitrile :acétate d’ammonium (9:1, v/v, concentration efficace en sel 20 mM), phase mobile B : acétonitrile/tampon en acétate d’ammonium (1:1, v/v, concentration efficace en sel 20 mM).
- Réglez le débit de phase mobile en fonction des paramètres suivants : démarrez le débit de phase mobile (0 à 3 min) à 100 % A, maintenez le débit pendant 3,0 min, puis passez à 100 % B en 5 min. Maintenez avec 100 % B jusqu’à 12 min, suivi de 8 min de temps de rééquilibrage de la colonne.
- Réglez la plage de balayage sur 85-1000 m/z. Réglez les paramètres de la source ionique HESI en mode d’ionisation positive sur : tension de pulvérisation 1 500 V, température capillaire 300 °C, gaz de gaine 40 a.u., débit de gaz auxiliaire 15 a.u., température du chauffage de la sonde 300 °C, niveau RF de l’objectif S 55 %.
- Analysez des échantillons de CQ composés de 10 μL de chaque échantillon analysé (régulièrement, tous les 10 à 12 échantillons) pour surveiller les performances de l’instrument.
- Pour la séparation en phase inverse, utilisez une colonne C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
- Réglez le débit à 200 μL/min, et les températures de l’échantillonneur automatique et de la colonne à 4 °C et 55 °C, respectivement. Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : H2O :MeOH (60 : 40, v/v), 10 mM d’acétate d’ammonium et 1 mM d’acide acétique ; phase B mobile : IPA :MeOH (90:10, v/v), 10 mM d’acétate d’ammonium et 1 mM d’acide acétique.
- Réglez le débit de phase mobile selon les paramètres suivants : 0 à 1 min (20 % B), 1 à 1,5 min (20 à 50 % B), 1,5 à 7,5 min (50 à 70 % B), 7,5 à 13 min (70 à 95 % B), 13 à 17 min (95 % B), 17 à 17,1 min (95 à 20 % B), 17,1 à 23 min (20 %).
- Pour la séparation HILIC, utilisez une colonne HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).
- Réglez le débit à 400 μL/min, et les températures de l’échantillonneur automatique et de la colonne à 4 °C et 40 °C, respectivement.
- Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : ACN ; phase mobile B : 5 mM d’acétate d’ammonium dans l’eau. Réglez le débit de phase mobile selon les paramètres suivants : 0 à 2 min (96 % B), 2 à 15 min (96 à 80 % B), 15 à 15,1 min (80 à 96 % B), 15,1 à 21 min (96 % B).
- Réglez les paramètres de la source ionique HESI en mode d’ionisation positive sur la tension de pulvérisation 3 500 V, la température capillaire 275 °C, le gaz de gaine 20 UA, le débit de gaz auxiliaire 10 UA, la température du réchauffeur de sonde 300 °C, le niveau RF S-Lens 55 %.
- Analysez des échantillons de CQ composés de 10 μL de chaque échantillon analysé (tous les 10 à 12 échantillons) pour surveiller les performances de l’instrument.
- Effectuez l’acquisition des données dans un logiciel compatible avec l’instrument.
6. Analyse des données
- Effectuer le traitement de données, l’identification présumée et l’analyse statistique à l’aide d’un logiciel dédié à l’analyse métabolomique et lipidomique non ciblée.
note: L’analyse en composantes principales (ACP) et les diagrammes à moustaches peuvent être obtenus pour visualiser la structure des données.
