Coloration de l’ADN extracellulaire : une méthode pour identifier l’ADN extracellulaire dans des coupes de tissus FFPE

Résumé

Source : O'Sullivan, K. M. et al. Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l'ADN extracellulaire dans la glomérulonéphrite. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit la technique de coloration de l’ADN extracellulaire dans des coupes de tissus FFPE. L’ADN extracellulaire coloré peut être quantifié pour déterminer l’efficacité de tout traitement thérapeutique conduisant à la mort des cellules cancéreuses.

Protocole

1. Coloration de l’ADNec avec du DAPI et de la β-actine

1. Placez les lames de verre dans une grille coulissante dans un four à 60 °C pendant 60 min.
2. Immerger les lames dans deux changements de solvant (xylène ou substitut) pendant 40 min chacune, dans une hotte.
3. Réhydratez les lames dans 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol et 70 % d’éthanol pendant 5 minutes chacune. Laver 5 min à l’eau du robinet.
4. Placez une plaque chauffante dans une hotte et faites bouillir une solution de récupération d’antigène (10 mM de Tris, 1 mM d’EDTA pH 9,0) dans un autocuiseur. Dès que la solution de récupération de l’antigène commence à bouillir, placez les lames dans la casserole horizontalement à l’aide d’une paire de pinces et verrouillez le couvercle. Faire bouillir à puissance élevée (équivalent à 15 psi ou 103 kPa) pendant 10 min
   note: Cette étape est cruciale car elle récupère l’antigène d’intérêt en démasquant l’épitope de l’antigène (réticulé via la fixation au formol) pour permettre la liaison spécifique de l’anticorps de l’épitope ; La coloration ultérieure ne fonctionnera pas sans lui.
5. Retirez l’autocuiseur du feu et retirez immédiatement le couvercle en faisant couler un robinet d’eau froide sur le couvercle d’un évier. Laissez les lames s’équilibrer pendant 20 minutes dans la solution de récupération de l’antigène.
6. Laver les lames deux fois pendant 5 minutes dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 M (pH 7,4) sur un agitateur orbital.
7. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour du tissu rénal, en faisant attention de ne laisser aucun tissu se dessécher pendant ce temps.
8. Bloquer du tissu dans du sérum de poulet à 10 % dans de l’albumine sérique bovine (BSA)/PBS à 5 % (pH 7,4, 0,01 M) pendant 30 min, 60 μL par section. Ne lavez pas après cette étape, mais retirez soigneusement la solution de blocage à l’aide d’une pipette de 60 μL, ne laissez pas les sections se dessécher.
9. Appliquer un cocktail d’anticorps primaires pour β-actine dilué 1/1000 dans 1 % BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μL par section et incuber une nuit dans une chambre humide à 4 °C.
10. Laver les lames deux fois pendant 5 min dans du PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un agitateur orbital.
11. Appliquer l’anticorps secondaire, poulet anti-lapin 488 (1/200), 60 μL par section dilué dans 1 % BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) pendant 40 min à RT.
12. Lavez les lames deux fois pendant 5 minutes dans du PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un agitateur orbital.
13. Immergez les lames dans 0,3 % de Sudan Black dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 min dans un bocal Coplin.
    note: Cette étape est importante car elle éteint l’autofluorescence causée par la fixation du formol.
14. Lavez les lames à l’eau du robinet pour éliminer le précipité, puis immergez-les dans du PBS (pH 7,4, 0,01 M) pendant 10 minutes pour éviter la formation d’un nouveau précipité noir du Soudan.
15. Montez les lames sur des lamelles confocales en verre à l’aide de trois gouttes de 60 μL de solution de montage avec DAPI et scellez les lamelles avec du vernis à ongles en appliquant sur le pourtour de la lamelle.
16. Laisser les lames durcir pendant 24 heures à RT (pour permettre au DAPI de pénétrer) puis les stocker à 4 °C à l’abri de la lumière.
    note: Important de rester dans l’obscurité pour éviter la décoloration des sondes fluorescentes.
17. Diapositives d’images à l’aide d’une tête de balayage laser confocale fixée à un microscope. Excite les diapositives avec le laser 405 pour DAPI et le laser 488 pour Beta Actin. Capturez des images à plan unique de 1024 x 1024 pixels à l’aide de la capture séquentielle linéaire et de la moyenne sur 4 lignes, ce qui est essentiel pour détecter l’ADNec. 40x objectif à huile 1,0 NA est utilisé.
    1. Imagez un minimum de 20 glomérules par échantillon. Enregistrez les images sous forme de fichiers ND2.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	sigma	A2153	Les solutions à 5 % et 1 % sont préparées dans du PBS, peuvent être préparées en vrac et congelées - jetées une fois décongelées
Anticorps IgG (H+L) de poulet à absorption croisée Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Faites tourner la mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant de l’utiliser pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Anticorps IgG (H+L) de poulet à absorption croisée, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Faites tourner la mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant de l’utiliser pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Poulet anti lapin IgG (H+L) anticorps à absorption croisée Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Faites tourner la mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant de l’utiliser pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Sérums de poulet	sigma	Réf. C5405	Composé de 1 % BSA/PBS
Lamelles 24x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Il ne s’agit pas d’une épaisseur standard conçue pour une utilisation en microscopie confocale
EDTA 10mM	sigma	E6758	Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH de 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x
Éthanol 30 %, 70 % et 100 %	Approvisionnement en chimie	UN1170	Fourni sous forme d’éthanol 100 % non dénaturé - dilué à 30 % et 70 % à l’aide d’eau distillée
Formaldéhyde, 4 % (10 % de formol tamponné neutre)	Trajan	NBF-500	Le rein est placé dans un tube de 5 ml contenant 3 ml de formol pendant 16 heures à RT, le formol doit être utilisé dans une hotte
Lames d’histologie en verre - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	Trajan	J3800AM4	L’utilisation de lames à revêtement chargé positivement est essentielle. Nous ne recommandons pas l’utilisation de la poly-L-lysine pour le revêtement des lames, car les tissus se délogent des lames pendant l’étape de récupération de l’antigène
Anticorps MPO anti humain/souris de chèvre	R&D	AF3667	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Stylo hydrophobe	Laboratoires VECTOR	H-400	Utiliser pour dessiner un cercle autour du tissu rénal
Saline tamponnée au phosphate	sigma	Réf. P38135	0,01 M PB/0,09 % NaCl Préparer 5 L à la fois
Autocuiseur 6L Tefal secure 5 Neo stainless	Tefal	GSA-P2530738	Acheté dans un magasin d’articles ménagers local
Prolong Gold DAPI	Technologies de la vie	Réf. P36962	Appliquer les gouttes directement sur la lamelle
Anticorps anti bêta-actine de lapin humain/souris	ABCAM	AB8227	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Anticorps H3Cit anti humain/souris	ABCAM	AB5103	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Étagère de coloration 24 lames	ProScitech	N° H4465	La grille de coloration choisie doit pouvoir résister à l’ébullition sous pression et à l’incubation dans un four à 60 degrés
Soudan Noir B	sigma	199664	0,3 % Ajouter 3g dans une bouteille de 1L dans 70 % d’éthanol, filtrer et protéger de la lumière - stable 6 mois à température ambiante
Tris 10mM	sigma	Réf. T4661	Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH à 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x
xylène	Trajan	Référence XL005/20	Doit être utilisé dans une hotte