Coloration de l’ADN extracellulaire : une méthode pour identifier l’ADN extracellulaire dans des coupes de tissus FFPE

Résumé

Source : O'Sullivan, K. M. et al. Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l'ADN extracellulaire dans la glomérulonéphrite. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit la technique de coloration de l’ADN extracellulaire dans des coupes de tissus FFPE. L’ADN extracellulaire coloré peut être quantifié pour déterminer l’efficacité de tout traitement thérapeutique conduisant à la mort des cellules cancéreuses.

Protocole

1. Coloration de l’ADNec avec du DAPI et de la β-actine

1. Placez les lames de verre dans une grille coulissante dans un four à 60 °C pendant 60 min.
2. Immerger les lames dans deux changements de solvant (xylène ou substitut) pendant 40 min chacune, dans une hotte.
3. Réhydratez les lames dans 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol et 70 % d’éthanol pendant 5 minutes chacune. Laver 5 min à l’eau du robinet.
4. Placez une plaque chauffante dans une hotte et faites bouillir une solution de récupération d’antigène (10 mM de Tris, 1 mM d’EDTA pH 9,0) dans un autocuiseur. Dès que la solution de récupération de l’antigène co....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	sigma	A2153	Les solutions à 5 % et 1 % sont préparées dans du PBS, peuvent être préparées en vrac et congelées - jetées une fois décongelées
Anticorps IgG (H+L) de poulet à absorption croisée Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Faites tourner la mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant de l’utiliser pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Anticorps IgG (H+L) de poulet à absorption croisée, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Faites tourner la mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant de l’utiliser pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Poulet anti lapin IgG (H+L) anticorps à absorption croisée Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Faites tourner la mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant de l’utiliser pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Sérums de poulet	sigma	Réf. C5405	Composé de 1 % BSA/PBS
Lamelles 24x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Il ne s’agit pas d’une épaisseur standard conçue pour une utilisation en microscopie confocale
EDTA 10mM	sigma	E6758	Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH de 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x
Éthanol 30 %, 70 % et 100 %	Approvisionnement en chimie	UN1170	Fourni sous forme d’éthanol 100 % non dénaturé - dilué à 30 % et 70 % à l’aide d’eau distillée
Formaldéhyde, 4 % (10 % de formol tamponné neutre)	Trajan	NBF-500	Le rein est placé dans un tube de 5 ml contenant 3 ml de formol pendant 16 heures à RT, le formol doit être utilisé dans une hotte
Lames d’histologie en verre - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	Trajan	J3800AM4	L’utilisation de lames à revêtement chargé positivement est essentielle. Nous ne recommandons pas l’utilisation de la poly-L-lysine pour le revêtement des lames, car les tissus se délogent des lames pendant l’étape de récupération de l’antigène
Anticorps MPO anti humain/souris de chèvre	R&D	AF3667	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Stylo hydrophobe	Laboratoires VECTOR	H-400	Utiliser pour dessiner un cercle autour du tissu rénal
Saline tamponnée au phosphate	sigma	Réf. P38135	0,01 M PB/0,09 % NaCl Préparer 5 L à la fois
Autocuiseur 6L Tefal secure 5 Neo stainless	Tefal	GSA-P2530738	Acheté dans un magasin d’articles ménagers local
Prolong Gold DAPI	Technologies de la vie	Réf. P36962	Appliquer les gouttes directement sur la lamelle
Anticorps anti bêta-actine de lapin humain/souris	ABCAM	AB8227	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Anticorps H3Cit anti humain/souris	ABCAM	AB5103	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Étagère de coloration 24 lames	ProScitech	N° H4465	La grille de coloration choisie doit pouvoir résister à l’ébullition sous pression et à l’incubation dans un four à 60 degrés
Soudan Noir B	sigma	199664	0,3 % Ajouter 3g dans une bouteille de 1L dans 70 % d’éthanol, filtrer et protéger de la lumière - stable 6 mois à température ambiante
Tris 10mM	sigma	Réf. T4661	Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH à 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x
xylène	Trajan	Référence XL005/20	Doit être utilisé dans une hotte

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