1. Préparation des réactifs
- Diluer décongelé 5x supplément de milieu de culture cellulaire hiPS (CCM) dans un milieu basal de culture cellulaire hiPS pour obtenir une solution 1x de hiPS CCM.
note: Le supplément de CCM hiPS 5x congelé nécessite un processus de décongélation lent, idéalement à 4 °C pendant la nuit. Les aliquotes du 1x hiPS CCM peuvent être stockées jusqu’à 6 mois à -20 °C.
- Préparation des plaques revêtues de la matrice de membrane basale (BM) 1 pour la culture de cellules hiPS : Décongeler la matrice BM 1 pendant la nuit sur de la glace à 4 °C. Une fois décongelés, préparez des aliquotes avec les facteurs de dilution appropriés, comme suggéré par le fabricant.
note: En règle générale, les aliquotes sont préparées pour être diluées ultérieurement dans 25 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL, suivies d’un mélange minutieux pour dissoudre complètement la matrice BM 1 et éviter la formation de cristaux résiduels.
- Transvaser 1 mL de la solution de la matrice BM 1 dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 h ou à 4 °C pendant au moins 24 h, enveloppé dans une pellicule de paraffine. Les plaques revêtues de la matrice BM 1 peuvent être stockées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparation des plaques à 2 couches de la matrice de membrane basale (BM) : Diluer des quantités appropriées de matrice BM 2 dans de l’eau distillée stérile de 9 mL pour obtenir une concentration finale de 5 μg/mL. Ajouter 700 μL de la solution de la matrice BM 2 dans chaque puits d’une plaque de 12 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h ou toute la nuit à 4 °C.
- Préparer des solutions mères de 100 μg/mL de BMP7, d’Activine A et de VEGF comme suit : Reconstituer BMP7 dans de l’eau distillée stérile contenant 0,1 % (en poids/vol) de BSA et reconstituer séparément l’Activine A et le VEGF dans du PBS stérile contenant 0,1 % (en poids/vol) de BSA. Pour éviter les cycles fréquents de congélation-décongélation, préparez des aliquotes de 100 μL à partir de chaque solution mère et conservez-la à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Préparez une solution mère de 10 mM de Y27632 en dissolvant 10 mg de Y27632 dans 3,079 mL d’eau distillée stérile. Aliquote 100 μL du stock et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Dissoudre 2 mg de CHIR99021 dans 143,4 μL de DMSO stérile pour préparer une solution mère de 30 mM. Préparez des aliquotes de 5 μL et conservez-les à -20 °C jusqu’à 1 mois (ou selon les recommandations du fabricant).
- Dissoudre 10 mg d’acide rétinoïque tout trans dans 3,33 mL de DMSO stérile. Préparez des aliquotes de 500 μL et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois.
2. Préparation des milieux de culture
- Préparez le milieu de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL d’Activine A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 et 1x supplément sans sérum B27 dans un volume approprié de DMEM/12 avec supplément de glutamine.
note: Le milieu de différenciation du mésoderme doit être fraîchement préparé avant les étapes de différenciation et à un volume approprié à l’échelle de l’expérience (généralement, 50 ml de milieu sont suffisants pour deux plaques à 12 puits).
- Préparez le milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL de BMP7, 3 μM de CHIR99021 et 1x supplément sans sérum B27 dans DMEM/F12 avec un supplément de glutamine.
note: Si nécessaire, le milieu peut être complété par 1 % (vol/vol) de pénicilline-streptomycine. Ajustez le volume du milieu en utilisant DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Ce milieu peut être préparé en grandes quantités ; cependant, il est recommandé de les conserver dans des aliquotes plus petites (p. ex., 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL) pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Ce support peut être stocké à -20 °C jusqu’à 3 mois et peut être décongelé à 4 °C pendant la nuit avant d’être utilisé.
- Préparez le milieu d’induction des podocytes en reconstituant à une concentration finale de 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL d’activine A, 50 ng/mL de VEGF, de 3 μM de CHIR99021, 1 supplément sans sérum B27 et d’acide rétinoïque tout trans 0,1 μM dans du DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Protégez le support de la lumière (par exemple, en enveloppant le récipient avec du papier d’aluminium).
note: Ce milieu peut être préparé en grandes quantités et stocké dans l’obscurité à -20 °C jusqu’à 3 mois. Les aliquotes congelées doivent être décongelées pendant la nuit à 4 °C avant d’être utilisées.
- Préparez 25 mL de solution neutralisante de trypsine en ajoutant 10 % (vol/vol) de FBS inactivé par la chaleur dans du DMEM/F12 et filtrez dans des conditions stériles.
- Pour l’entretien post-différenciation des podocytes dérivés de cellules souches, préparer le milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes en ajoutant le supplément au milieu basal conformément aux directives du fabricant, et le conserver à 4 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines.
3. Culture cellulaire hiPS sans feeder à l’aide d’un milieu de culture cellulaire hiPS
- Aspirer la solution résiduelle de la matrice BM 1 des plaques pré-enrobées et laver les puits 3 fois avec 1 à 2 mL de DMEM/F12 réchauffé.
- Aspirez le CCM hiPS épuisé des cellules hiPS et rincez les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 réchauffé. Ajouter 1 mL de solution chaude de décollement cellulaire et incuber pendant 1 min à 37 °C pour aider à dissocier les cellules. Effectuez une inspection visuelle des cellules sous un microscope de culture tissulaire et assurez-vous que les bords des colonies cellulaires semblent arrondis, puis aspirez rapidement la solution de détachement cellulaire des cellules (en vous assurant que les colonies cellulaires sont toujours attachées à la plaque, bien que lâchement). Rincez doucement les cellules une fois avec du DMEM/F12 pour éliminer la solution de décollement de cellules.
- Ajouter 3 mL de hiPS CCM aux cellules hiPS (dans chaque puits d’une plaque à 6 puits) qui ont été traitées avec la solution de détachement cellulaire. Grattez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules et pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules sont récoltées.
note: L’utilisation d’une pipette de 5 mL est recommandée pour éviter un cisaillement excessif sur les cellules.
- Transférez 0,5 mL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une nouvelle matrice BM à 1 couche de plaque à 6 puits contenant 2 mL de hiPS CCM par puits. Déplacez la plaque en huit pour répartir les colonies cellulaires dans les puits et incubez à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchir le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être passées ou utilisées pour l’expérience de différenciation (environ 70 % de confluence).
note: La taille idéale de la colonie pour le passage régulier des iPSC se situe entre 200 et 500 μm dans des conditions sans mangeoire avec des CCM hiPS (sans inhibiteur de ROCK). Si les cellules sont individualisées pendant le traitement avec des enzymes de dissociation ou des tampons, le hiPS CCM peut être complété par un inhibiteur de ROCK (par exemple, 10 μM Y27632) pour améliorer la viabilité cellulaire.
4. Différenciation des cellules hiPS en cellules mésodermiques (jours 0 à 2)
- Alors que les cultures de cellules hiPS sont en phase de croissance exponentielle (environ dans les 4 jours suivant la culture après le passage et environ 70 % de confluence), inspectez visuellement la présence de cellules spontanément différenciées à l’intérieur et autour des limites des colonies. Si nécessaire, grattez aseptiquement les zones de différenciation.
- Aspirez hiPS CCM des cellules hiPS et rincez les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 chaud. Incuber les cellules avec 1 ml de tampon de dissociation cellulaire exempt d’enzymes pendant 10 min à 37 °C et vérifier la dissociation au microscope. En raison des différences inhérentes entre les différentes lignées cellulaires hiPS, le temps d’incubation réel du tampon de dissociation cellulaire doit être déterminé pour une lignée cellulaire donnée.
- Raclez doucement le puits à l’aide d’un élévateur de cellules pour déloger les cellules faiblement adhérentes et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml, puis pipetez de haut en bas plusieurs fois pour individualiser les cellules hiPS.
- Amener la suspension cellulaire à un volume de 15 mL avec du DMEM/F12 chaud et centrifuger pendant 5 min à 290 x g à température ambiante.
- Aspirez doucement le surnageant et remettez les cellules en suspension avec du DMEM/F12 chaud pour un autre cycle de centrifugation afin d’éliminer les composants résiduels de la matrice BM 1 et du tampon de dissociation.
- Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu d’induction du mésoderme comme décrit ci-dessus. Comptez le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de socs pour déterminer le volume approprié de milieu de différenciation du mésoderme nécessaire pour atteindre une concentration de 1 x 105 cellules/ml.
- Aspirez la solution ECM des plaques revêtues de la matrice BM 2 et rincez les plaques deux fois avec du DMEM/F12 chaud. Mélangez doucement la suspension de cellules hiPS en pipetant plusieurs fois. Transférez 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits de la matrice BM à 2 couches et des plaques à 12 puits, puis secouez doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément.
- Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu d’induction du mésoderme le lendemain.
note: Après 2 jours, les cellules du mésoderme dérivées des cellules hiPS seraient prêtes pour l’induction intermédiaire du mésoderme.
5. Différenciation des cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS en mésoderme intermédiaire (jours 2 à 16)
- Le jour 2 du protocole de différenciation, aspirer le milieu d’induction du mésoderme et remplir avec 1 ml par milieu d’induction du mésoderme intermédiaire bien situé.
- Rafraîchissez le milieu tous les jours pour maintenir un seuil précis de facteurs de croissance et de petites molécules pour les cellules métaboliquement actives. S’il y a une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments du milieu (indiqué par le jaunissement du milieu), le volume du milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme peut être augmenté à 1,3 mL par puits des plaques à 12 puits.
- Cultivez des cellules pendant 14 jours supplémentaires pour obtenir des cellules médiodermiques intermédiaires. Au 16e jour, ces cellules peuvent être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.
6. Différenciation des cellules intermédiaires du mésoderme dérivées des cellules hiPS en podocytes (jours 16 à 21)
- Rincer les cellules intermédiaires du mésoderme avec du DMEM/F12 chaud, puis incuber les cellules avec 0,5 mL par puits de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 min à 37 °C. Effectuer une inspection visuelle pour s’assurer que les cellules commencent à se dissocier.
- Grattez les cellules à l’aide d’un lève-cellule et pipetez la suspension cellulaire plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour obtenir des cellules individualisées (ou de petits amas de).
note: À ce stade, assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées, car les cellules agrégées peuvent ne pas parvenir à acquérir un phénotype différencié en phase terminale dans la chronologie du protocole.
- Ajouter environ 2 ml par puits de solution neutralisante de trypsine pour arrêter l’activité de la trypsine.
- Transférez les cellules dans un tube conique de 50 mL et amenez le volume à 50 mL à l’aide de DMEM/F12, puis centrifugez la suspension cellulaire pendant 5 min à 201 x g à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le milieu d’induction des podocytes. Pour des résultats optimaux, assurez-vous d’une densité de semis finale d’environ 100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez la suspension cellulaire aux plaques revêtues de la matrice BM 2 et secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément.
- Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 et rafraîchir le milieu quotidiennement jusqu’à 5 jours pour obtenir des podocytes par jour 21,
note: Les podocytes dérivés des cellules hiPS qui en résultent peuvent être maintenus en culture pendant 2 à 4 semaines supplémentaires en utilisant un milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes. Une fois dans le milieu d’entretien des podocytes, les cellules peuvent être nourries tous les deux jours et peuvent être utilisées pour des études ultérieures ou des analyses en aval.