Isolement des cellules musculaires lisses du détrusor : une procédure de digestion enzymatique pour obtenir des cellules DSM à partir d’échantillons de vessie urinaire humaine

Résumé

Source : Malysz, J. et al. Préparation et utilisation de cellules musculaires lisses de détrusor humain fraîchement isolées pour la caractérisation des courants cationiques sensibles au 9-phénanthrol. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des cellules musculaires lisses détrusor à partir d’échantillons de vessie urinaire humaine à l’aide d’un traitement enzymatique séquentiel en deux étapes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Dissection de tissus DSM et préparation de morceaux DSM exempts de muqueuse

1. Examiner l’échantillon de vessie de toute épaisseur qui est arrivé au laboratoire en provenance de la salle d’opération dans un récipient hermétiquement fermé rempli de la solution froide de dissection/digestion (figure 1 et tableau 1 pour la composition de la DS).
   note: L’échantillon est généralement conservé dans une DS froide de quelques heures à toute la nuit avant d’arriver au laboratoire. Pour un stockage plus long, le DS (Tableau 1) est complété par 1 mM de CaCl₂.
2. Retirez et rincez l’échantillon de DSM humain de toute épaisseur (contenant toutes les couches, y compris la muqueuse, le DSM et la séreuse) avec du DS glacé pour éliminer les débris et le sang attachés.
3. Épinglez l’échantillon de la vessie, muqueuse vers le haut et séreuse vers le bas, dans une boîte ronde de 150 mm de diamètre recouverte d’énantiomère de silicone remplie de DS glacé (Figure 1B).
4. Retirez le tissu adipeux adjacent, les vaisseaux sanguins, l’épithélium (urothélium) et la muqueuse musculaire de l’échantillon par dissection nette à l’aide de microciseaux et de pinces.
5. Découper plusieurs morceaux de DSM exempts de muqueuse (~2 à 3 mm de long et 4 à 6 mm de large) (Figure 1C).

2. Dissociation enzymatique de morceaux de MNS produisant des cellules DSM uniques fraîchement isolées

1. Placez 3 à 6 morceaux de DSM dans un tube contenant 1 à 2 mL de DS préchauffé (~37 °C) contenant de la papaïne et du dithiothréitol (DS-P, tableau 1) et incubez des morceaux de DSM dans du DS-P pendant 30 à 45 min à ~37 °C en secouant doucement le tube de temps en temps (une fois toutes les 10 à 15 min).
   note: Pour contrôler de manière optimale la température du traitement enzymatique, des tubes contenant des morceaux de tissu et des solutions enzymatiques sont placés soit dans une chambre en tissu en verre remplie d’eau reliée à un bain-marie chauffé en circulation (Figure 1D), soit dans un bain-marie à agitation à température contrôlée de haute précision (Figure 1E).
2. Retirez le DS-P du tube, lavez brièvement les pièces DSM avec du DS glacé, jetez le DS froid du tube en laissant les morceaux DSM au fond du tube.
3. Ajouter 1 à 2 ml de collagénase de type II CONTENANT DU DS (DS-C, Tableau 1) dans le tube avec des morceaux de DSM ; mélanger doucement et incuber pendant 25 à 40 minutes à ~37 °C en secouant doucement le tube de temps en temps (toutes les 10 à 15 minutes).
4. Jetez le DS-C et lavez les morceaux de DSM traités aux enzymes 5 à 10 fois avec du DS glacé.
5. Après le dernier lavage, laissez la solution DS à l’intérieur du tube ; triturez doucement avec une pipette Pasteur polie au feu plusieurs fois pour libérer les cellules DSM individuelles.
6. Placez quelques gouttes de solution DS contenant des cellules DSM dispersées sur une chambre à fond de verre ou une lamelle et inspectez visuellement la qualité au microscope (à l’aide d’un objectif 20x ou 40x) après au moins 5 minutes après l’application pour permettre aux cellules d’adhérer au fond.
7. Utilisez immédiatement des cellules DSM fraîchement isolées pour des expériences électrophysiologiques ou conservez les cellules dans un tube contenant des DS à ~4 °C, soit sur de la glace, soit dans un réfrigérateur jusqu’à utilisation (généralement jusqu’à 8 h de préparation).
   note: Au sein d’une même préparation, la qualité des cellules varie de très viables à des cellules DSM mortes surdigérées (Figure 2). Lorsque la méthode séquentielle papaïne-collagénase produit un nombre très élevé de cellules non viables, la préparation est jetée et une nouvelle digestion des morceaux de DSM est effectuée, mais avec des intervalles d’incubation réduits. Si la procédure aboutit à un nombre insuffisant de cellules DSM, les intervalles d’incubation sont augmentés pour la digestion ultérieure des morceaux DSM. L’immunoréactivité positive à l’actine du muscle α-lisse confirme l’identité des cellules du DSM (Figure 3).

Type de solution	Composition (en mM)
DS (solution de dissection/digestion)	80 Na-glutamate, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 et 11 glucose, pH ajusté à 7,4 (avec 10 M NaOH)
DS-P (contenant de la papaïne)	ED contenant 1 à 2 mg/ml de papaïne, 1 mg/ml de dithiothréitol et 1 mg/ml d’albumine sérique bovine
DS-C (SD contenant de la collagénase)	Solution SD contenant 1 à 2 mg/ml de collagénase de type II, 1 mg/ml d’albumine sérique bovine, 0 ou 1 mg/ml d’inhibiteur de la trypsine et 100 à 200 μM de Ca2+
P (pipette)	110 CsOH, 110 acide aspartique, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA et 30 CsCl, pH ajusté à 7,2 avec CsOH et complété par de l’amphotéricine-B (300-500 μg/ml)
E (extracellulaire)	10 chlorure de tétraéthylammonium (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES et 10 glucose, pH ajusté à 7,3-7,4 avec NaOH ou CsOH, et 0,002-3 (2-3 mM) nifédipine

Tableau 1 : Compositions de solution de dissection/digestion (DS), de pipette et de solutions extracellulaires utilisées dans les expériences de patch-clamp perforé.

Résultats

Figure 1 : Résumé des étapes de dissection aboutissant à la préparation des morceaux de muscle lisse détrusor (DSM) et à la configuration utilisée pour la dissociation enzymatique. Des images sont montrées : (A) d’un échantillon de vessie urinaire humaine d’une épaisseur totale provenant d’une chirurgie de la vessie ouverte en tant que matériau chirurgical étr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml	Faucon	352054	Tubes pour SD contenant des enzymes utilisées dans les étapes de digestion
Mélangeur vortex analogique	VWR	Référence 58816-121
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	Réf. C1016	Solution extracellulaire et DS
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Chélateur Ca2+, utilisé dans une solution de pipette intracellulaire
glucose	sigma	Référence G8270
Collagénase de type 2	Société biochimique Worthington	LS004177	DS-C
Hydrate d’hydroxyde de césium	Sigma-Aldrich	Réf. C8518	Solution de pipette intracellulaire
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Solutions extracellulaires et intracellulaires
DL-Dithiothréitol (DDT)	Sigma-Aldrich	D9779	Agents réducteurs utilisés avec la papaïne
NaOH	Sigma-Aldrich	Réf. S8045
Nifédipine	Sigma-Aldrich	N7634 (en anglais	Bloqueur de canaux Ca2+ voltage-dépendant de type L
Support/support de tube en mousse flottant	VWR Scientific	Référence 82017-634	Utilisé pour maintenir des tubes avec des enzymes pour le contrôle de la température
Acide glutamique (sel Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
Papaïne	Société biochimique Worthington	LS003126	DS-P
MgCl2 (hexahydraté)	Sigma-Aldrich	M2670	Solutions extracellulaires et intracellulaires
Kcl	Fisher Scientific	BP366-1	Solution extracellulaire
NaCl	Sigma-Aldrich	Réf. S7653	Solutions extracellulaires et intracellulaires
Aiguille de seringue non métallique, MicroFil	WPI	Référence MF-34G-5	Remplissage de la solution de pipette intracellulaire
Pipette Pasteur	FisherBrand	Référence 13-678-20A	Les pointes sont cassées et polies au feu et utilisées pour le titrage des tissus traités par voie enzymatique afin de libérer des cellules DSM uniques à partir de morceaux
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H3375	Tampon de pH
Bain-marie à agitation de précision Thermo Scientific (modèle 2870)	Thermo Scientific	Abandonné	Bain-marie pour le contrôle de la température de la digestion enzymatique utilisé comme alternative à la configuration du bain de circulation dans une chambre tissulaire
Tubes en vinyle	ColePalmer	Référence 06405-3	Utilisations multiples, y compris pour relier un bain de tissu à un bain d’eau en circulation
Bain circulateur d’eau, Haake D1 L	Haake	Abandonné	Connecté au bain de tissus
Microscope inversé ZeissAxiovert 40C avec objectifs 10x et 40x	Carl-Zeiss	Abandonné	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation

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