Analyse par patch-clamp perforé médié par l’amphotéricine B : une technique électrophysiologique pour étudier les courants ioniques dans les cellules de la vessie

Résumé

Source : Malysz, J. et al. Préparation et utilisation de cellules musculaires lisses de détrusor humain fraîchement isolées pour la caractérisation des courants cationiques sensibles au 9-phénanthrol. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre la caractérisation des courants cationiques des canaux ioniques de la mélastatine de type 4 (TRPM4) dans les cellules musculaires lisses du détrusor à l’aide de la technique de patch-clamp perforé médiée par l’amphotéricine B. La technique permet d’évaluer les propriétés biophysiques et pharmacologiques des canaux ioniques.

Protocole

1. Enregistrement des courants cationiques induits par paliers de tension à partir de cellules DSM à l’aide de la technique de patch-clamp de tension de cellules entières perforées d’amphotéricine B

1. Pipeter 0,25 à 1 ml de suspension cellulaire dans une chambre à fond de verre posée sur une platine d’un microscope inversé et laisser les cellules adhérer au fond de verre.
2. Après une incubation d’au moins 45 min, retirer la solution de digestion (DS) du bain et la remplacer par la solution E (Tableau 1) par superfusion où la solution assistée par gravité s’écoule via la tubulure d’entr....

Résultats

Figure 1 : Illustration schématique des étapes impliquées dans la formation du giga-seal et la perforation de l’amphotéricine-B des cellules humaines du DSM. Les positions spatiales d’une pipette contenant de l’amphotéricine B et d’une cellule DSM, ainsi que les réponses associées pour les tests membranaires obtenues dans le logiciel d’acquisition commercial (Table des.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml	Faucon	352054	Tubes pour SD contenant des enzymes utilisées dans les étapes de digestion
Amphotéricine-B	pêcheur	BP928-250	Utilisé pour la perforation de patch/cellule
Amphotéricine-B	Étalons de référence de la Pharmacopée européenne	5	Utilisé pour la perforation de patch/cellule
Amphotéricine-B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Utilisé pour la perforation de patch/cellule
Mélangeur vortex analogique	VWR	Référence 58816-121
acide aspartique	Sigma-Aldrich	A9006	Solution de pipette intracellulaire
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	Réf. C1016	Solution extracellulaire et DS
Verre capillaire	Sutter	BF150-110-7.5	Capillaire pour la préparation d’électrodes patch tirées
Hydrate d’hydroxyde de césium	Sigma-Aldrich	Réf. C8518	Solution de pipette intracellulaire
Le logiciel Clampex version 10 comprend des programmes d’acquisition de données (Clampex) et d’analyse (Clampfit)	Axon Instruments/ Dispositifs moléculaires	pCLAMP-10	Logiciel commercial et partie de la configuration de la plate-forme de patch-clamp
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Solutions extracellulaires et intracellulaires
Cire dentaire	Miltex Dental Wax Technologies, Inc.	18058351
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	solvant
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Chélateur Ca2+, utilisé dans une solution de pipette intracellulaire
Extracteur de micropipette flamboyant/marron	Sutter	P-97	Nécessaire pour tirer des électrodes avec des pointes très fines
Support/support de tube en mousse flottant	VWR Scientific	Référence 82017-634	Utilisé pour maintenir des tubes avec des enzymes pour le contrôle de la température
glucose	sigma	Référence G8270
Acide glutamique (sel Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H3375	Tampon de pH
Kcl	Fisher Scientific	BP366-1	Solution extracellulaire
Système d’acquisition de données à faible bruit	Axon Instruments/ Dispositifs moléculaires	Digidata 1440A	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation
Agitateur magnétique	VWR	Tél. : 01-442-684
MgCl2 (hexahydraté)	Sigma-Aldrich	M2670	Solutions extracellulaires et intracellulaires
MicroForge	Narishige	Réf. MF-830	Utilisé pour le polissage au feu des électrodes
NaCl	Sigma-Aldrich	Réf. S7653	Solutions extracellulaires et intracellulaires
NaOH	Sigma-Aldrich	Réf. S8045
Nifédipine	Sigma-Aldrich	N7634 (en anglais	Bloqueur de canaux Ca2+ voltage-dépendant de type L
Microscope inversé Nikon, TS100 avec platine T1-SM avec objectifs 5x, 10x, 20x et 40x	Nikon	Abandonné	Partie de la configuration de la plate-forme Patch-clamp
Aiguille de seringue non métallique, MicroFil	WPI	Référence MF-34G-5	Remplissage de la solution de pipette intracellulaire
Pipette Pasteur	FisherBrand	Référence 13-678-20A	Les pointes sont cassées et polies au feu et utilisées pour le titrage des tissus traités par voie enzymatique afin de libérer des cellules DSM uniques à partir de morceaux
Amplificateur patch-clamp	Axon Instruments/ Dispositifs moléculaires	Axon Axopatch 200B	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation
Ordinateur PC	vallon	Configuration personnalisée	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation
Ph-mètre	Aspera Instruments	PH700
Tubes en polyéthylène	Intramédic	427 à 436	Tube pour la superfusion d’un bain extracellulaire relié à une chambre d’enregistrement à fond de verre
Chlorure de tétraéthylammonium	Sigma-Aldrich	Réf. T2265	Bloqueur de canaux ioniques des canaux Kv et BK ajouté à la solution de bain extracellulaire
Échelle de pondération	Mettler Toledo	XS64
Microscope inversé ZeissAxiovert 40C avec objectifs 10x et 40x	Carl-Zeiss	Abandonné	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation

)