Analyse par patch-clamp perforé médié par l’amphotéricine B : une technique électrophysiologique pour étudier les courants ioniques dans les cellules de la vessie

Abstract

Source : Malysz, J. et al. Préparation et utilisation de cellules musculaires lisses de détrusor humain fraîchement isolées pour la caractérisation des courants cationiques sensibles au 9-phénanthrol. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre la caractérisation des courants cationiques des canaux ioniques de la mélastatine de type 4 (TRPM4) dans les cellules musculaires lisses du détrusor à l’aide de la technique de patch-clamp perforé médiée par l’amphotéricine B. La technique permet d’évaluer les propriétés biophysiques et pharmacologiques des canaux ioniques.

Protocol

1. Enregistrement des courants cationiques induits par paliers de tension à partir de cellules DSM à l’aide de la technique de patch-clamp de tension de cellules entières perforées d’amphotéricine B

1. Pipeter 0,25 à 1 ml de suspension cellulaire dans une chambre à fond de verre posée sur une platine d’un microscope inversé et laisser les cellules adhérer au fond de verre.
2. Après une incubation d’au moins 45 min, retirer la solution de digestion (DS) du bain et la remplacer par la solution E (Tableau 1) par superfusion où la solution assistée par gravité s’écoule via la tubulure d’entrée remplace lentement la DS par la nouvelle solution tandis que la tubulure de sortie reliée à un récipient de déchets sous vide élimine la solution de la chambre et empêche le débordement.
   note: La solution E contient des ions tétraéthylammonium (TEA⁺) et césium (Cs⁺) pour inhiber les courants K⁺.
3. Préparez une solution mère d’amphotéricine B dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) (1 mg pour 10 μL de DMSO). Pour dissoudre complètement la poudre d’amphotéricine, sonicate (au moins 15 min) et bien agiter la solution.
   note: Cette étape prend généralement moins de 10 min. La dissolution de 3 à 4 mg d’amphotéricine B dans 30 à 40 μL de DSMO dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL fonctionne bien. Des quantités plus élevées d’amphotéricine B nécessitent plus de solvant DSMO, ce qui entraîne généralement un intervalle plus long pour le mélange et une solubilisation incomplète des particules solides d’amphotéricine B présentes dans le tube.
4. Dissoudre la solution mère d’amphotéricine B dans la solution de pipette (solution P, tableau 1) pour obtenir une concentration finale de 200 à 500 μg/mL. Cette étape nécessite une sonication et un vortex étendus à grande vitesse (8–10/10) pendant ~30 à 60 min par étape pour assurer un mélange optimal et prévenir la formation de précipités d’amphotéricine B dans la solution de pipette.
   note: L’amphotéricine-B précipite avec le temps et est sensible à la lumière. La solubilité de la solution de pipette fonctionnelle contenant de l’amphotéricine B est vérifiée, mélangée à la main avant le remplissage de la pipette et conservée dans l’obscurité.
5. Tirez plusieurs électrodes de patch, polissez au feu les pointes des électrodes et (si nécessaire) enduisez les pointes de cire dentaire.
6. Remplissez l’extrémité d’une électrode patch avec la solution de pipette (solution P, tableau 1) sans amphotéricine-B en trempant brièvement l’électrode dans la solution.
7. Remplissez l’électrode avec la même solution de pipette contenant de l’amphotéricine B.
8. Montez l’électrode sur un support connecté à une tête d’amplificateur patch-clamp.
9. À l’aide d’un micromanipulateur, placez l’électrode juste sous la surface de la solution extracellulaire de sorte que la pointe de l’électrode soit juste immergée.
10. En mode pince de tension, réglez le potentiel de maintien sur 0 mV et ajustez le courant à 0 pA avec le cadran de décalage de la pipette sur l’amplificateur commercial (Tableau des matériaux).
11. Déterminez la résistance de l’électrode à l’aide de la fenêtre/fonction de test de membrane du logiciel d’acquisition commercial (table des matériaux). Pour l’activer, cliquez sur Outils>Test de membrane>Play ou sur une icône de raccourci dans le logiciel. La résistance de l’électrode déterminée doit être comprise entre 2 et 5 MΩ.
    note: La fonction de test de membrane fournie dans le logiciel d’acquisition commerciale ou l’option de test d’étanchéité sur l’amplificateur peut être utilisée pour surveiller la résistance de l’électrode en appliquant des pas de tension de manière répétitive.
12. Continuez à surveiller la résistance de l’électrode tout en faisant avancer l’électrode vers une cellule DSM choisie à l’aide d’un micromanipulateur (Figure 1A).
    note: Pour être considérée comme une cellule DSM viable, la cellule doit présenter une morphologie allongée en forme de fuseau, un halo bien défini autour de la cellule, des bords nets et un aspect semi-contractile (serpentin).
13. Lorsque vous touchez la surface de la cellule avec l’électrode, indiquée par une augmentation rapide de la résistance de l’électrode mesurée à l’aide de la fonction de test de membrane, formez un giga-joint en appliquant une légère pression négative rapide sur le porte-électrode via un tube. Il en résulte une pression négative créée à l’extrémité de l’électrode qui tire la membrane cellulaire dans l’électrode, ce qui contribue à la formation d’un giga-seal, ou d’un contact très étroit entre l’électrode et la membrane plasmique (Figure 1B).
14. Une fois le giga-seal formé, compensez la capacité de la pipette en ajustant les cadrans rapides et lents de l’amplificateur commercial et surveillez la stabilité du giga-seal (courant de fuite) à l’aide de la fonction de test de membrane.
15. Prévoyez généralement 30 à 60 minutes pour que l’amphotéricine B se diffuse dans la pipette et soit insérée dans la membrane plasmique, formant des pores principalement sélectifs aux cations monovalents. Au cours de cette étape, continuez à surveiller le giga-seal avec la fonction de test de membrane. À mesure que la perforation de la cellule augmente, l’amplitude des transitoires de capacité (comparez la figure 1B et la figure 1C montrant l’absence de perforation cellulaire et la perforation effective de la cellule, respectivement) mesurée avec la fonction de test de membrane, augmente également.
16. Lorsque la perforation du patch est optimale (jugée par une résistance série stable généralement inférieure à 50 MΩ), annulez les transitoires de capacité en ajustant les cadrans pour la capacité de la cellule et la résistance en série sur l’amplificateur. La compensation de résistance en série peut également être effectuée à ce moment (Figure 1D).
17. Une fois que des courants cationiques stables induits par l’échelon de tension évoqués par le protocole spécifié sont observés, appliquez un composé ou une condition physiologique pour tester par superfusion et enregistrez les réponses pour la condition de contrôle, la condition d’essai et le lavage (si possible) avec le logiciel d’acquisition commercial.
    1. Enregistrez les courants à l’aide d’un protocole de tension à pas de routine qui implique de maintenir les cellules DSM à -64 ou -74 mV et d’augmenter la tension par incréments de 10 mV pendant 400 ou 500 ms de -94 à +96 ou +106 mV et de revenir au potentiel de maintien.
       note: Les valeurs de potentiel de membrane sont ajustées pour un potentiel de jonction liquide de 14 mV (en utilisant les solutions P et E, tableau 1). Le potentiel de jonction liquide est obtenu dans le logiciel d’acquisition commerciale (Table des matériaux) en cliquant sur Outils>Potentiels de jonction et en entrant les concentrations des composants ioniques dissolution. Un protocole de rampe peut également être utilisé pour obtenir les enregistrements actuels.
    2. Exécutez le protocole de tension dans un intervalle continu de ~1 minute pendant une expérience en enregistrant les courants pour le contrôle de pré-addition, l’état de test et le lavage

Type de solution	Composition (en mM)
DS (solution de dissection/digestion)	80 Na-glutamate, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 et 11 glucose, pH ajusté à 7,4 (avec 10 M NaOH)
DS-P (contenant de la papaïne)	DS contenant 1 à 2 mg/ml de papaïne, 1 mg/ml de dithiothréitol et 1 mg/ml d’albumine sérique bovine
DS-C (SD contenant de la collagénase)	Solution SD contenant 1 à 2 mg/ml de collagénase de type II, 1 mg/ml d’albumine sérique bovine, 0 ou 1 mg/ml d’inhibiteur de la trypsine et 100 à 200 μM Ca2+
P (pipette)	110 CsOH, 110 acide aspartique, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA et 30 CsCl, pH ajusté à 7,2 avec CsOH et complété par de l’amphotéricine-B (300-500 μg/ml)
E (extracellulaire)	10 chlorure de tétraéthylammonium (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES et 10 glucose, pH ajusté à 7,3-7,4 avec NaOH ou CsOH, et 0,002-3 (2-3 mM) nifédipine

Tableau 1 : Compositions de solution de dissection/digestion (DS), de pipette et de solutions extracellulaires utilisées dans les expériences de patch-clamp perforé.

Results

Figure 1 : Illustration schématique des étapes impliquées dans la formation du giga-seal et la perforation de l’amphotéricine-B des cellules humaines du DSM. Les positions spatiales d’une pipette contenant de l’amphotéricine B et d’une cellule DSM, ainsi que les réponses associées pour les tests membranaires obtenues dans le logiciel d’acquisition commercial (Table des...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml	Faucon	352054	Tubes pour SD contenant des enzymes utilisées dans les étapes de digestion
Amphotéricine-B	pêcheur	BP928-250	Utilisé pour la perforation de patch/cellule
Amphotéricine-B	Étalons de référence de la Pharmacopée européenne	5	Utilisé pour la perforation de patch/cellule
Amphotéricine-B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Utilisé pour la perforation de patch/cellule
Mélangeur vortex analogique	VWR	Référence 58816-121
acide aspartique	Sigma-Aldrich	A9006	Solution de pipette intracellulaire
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	Réf. C1016	Solution extracellulaire et DS
Verre capillaire	Sutter	BF150-110-7.5	Capillaire pour la préparation d’électrodes patch tirées
Hydrate d’hydroxyde de césium	Sigma-Aldrich	Réf. C8518	Solution de pipette intracellulaire
Le logiciel Clampex version 10 comprend des programmes d’acquisition de données (Clampex) et d’analyse (Clampfit)	Axon Instruments/ Dispositifs moléculaires	pCLAMP-10	Logiciel commercial et partie de la configuration de la plate-forme de patch-clamp
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Solutions extracellulaires et intracellulaires
Cire dentaire	Miltex Dental Wax Technologies, Inc.	18058351
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	solvant
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Chélateur Ca2+, utilisé dans une solution de pipette intracellulaire
Extracteur de micropipette flamboyant/marron	Sutter	P-97	Nécessaire pour tirer des électrodes avec des pointes très fines
Support/support de tube en mousse flottant	VWR Scientific	Référence 82017-634	Utilisé pour maintenir des tubes avec des enzymes pour le contrôle de la température
glucose	sigma	Référence G8270
Acide glutamique (sel Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H3375	Tampon de pH
Kcl	Fisher Scientific	BP366-1	Solution extracellulaire
Système d’acquisition de données à faible bruit	Axon Instruments/ Dispositifs moléculaires	Digidata 1440A	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation
Agitateur magnétique	VWR	Tél. : 01-442-684
MgCl2 (hexahydraté)	Sigma-Aldrich	M2670	Solutions extracellulaires et intracellulaires
MicroForge	Narishige	Réf. MF-830	Utilisé pour le polissage au feu des électrodes
NaCl	Sigma-Aldrich	Réf. S7653	Solutions extracellulaires et intracellulaires
NaOH	Sigma-Aldrich	Réf. S8045
Nifédipine	Sigma-Aldrich	N7634 (en anglais	Bloqueur de canaux Ca2+ voltage-dépendant de type L
Microscope inversé Nikon, TS100 avec platine T1-SM avec objectifs 5x, 10x, 20x et 40x	Nikon	Abandonné	Partie de la configuration de la plate-forme Patch-clamp
Aiguille de seringue non métallique, MicroFil	WPI	Référence MF-34G-5	Remplissage de la solution de pipette intracellulaire
Pipette Pasteur	FisherBrand	Référence 13-678-20A	Les pointes sont cassées et polies au feu et utilisées pour le titrage des tissus traités par voie enzymatique afin de libérer des cellules DSM uniques à partir de morceaux
Amplificateur patch-clamp	Axon Instruments/ Dispositifs moléculaires	Axon Axopatch 200B	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation
Ordinateur PC	vallon	Configuration personnalisée	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation
Ph-mètre	Aspera Instruments	PH700
Tubes en polyéthylène	Intramédic	427 à 436	Tube pour la superfusion d’un bain extracellulaire relié à une chambre d’enregistrement à fond de verre
Chlorure de tétraéthylammonium	Sigma-Aldrich	Réf. T2265	Bloqueur de canaux ioniques des canaux Kv et BK ajouté à la solution de bain extracellulaire
Échelle de pondération	Mettler Toledo	XS64
Microscope inversé ZeissAxiovert 40C avec objectifs 10x et 40x	Carl-Zeiss	Abandonné	Fait partie de la configuration d’un appareil de réparation