Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
REMARQUE : Des souris saines de type sauvage (WT) non traitées (n = 4) et des souris cd44-/- (n = 4) ont été sacrifiées à l’âge de 12 à 16 semaines. Des souris mâles et femelles ont été utilisées. Toutes les souris étaient sur le fond C57Bl/6.
1. Dissection rénale de souris
- Sacrifiez des souris WT saines ou des souris génétiquement modifiées par luxation cervicale.
- Disséquez des reins de souris entiers directement après avoir sacrifié les souris. Pour cela, effectuez une laparotomie médiane à l’aide de ciseaux abdominaux, en coupant la peau puis les muscles abdominaux. Retirez l’intestin et placez-le à côté de la souris.
- Libérez les reins des tissus de connexion et retirez le rein à l’aide d’une pince chirurgicale, en coupant l’artère rénale, la veine rénale et l’uretère avec des ciseaux.
- Retirez les capsules rénales des reins en tenant le rein à l’aide d’une pince chirurgicale et retirez la capsule à l’aide d’une autre paire de pinces.
- Placez les reins dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits (2 reins/puits) préparée avec 2 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) par puits et placez-les sur de la glace.
2. Isolement des glomérules du rein de souris
- Transférez les reins dans une boîte de Pétri de 100 mm et coupez les reins en petits morceaux de 1 à 2 mm à l’aide de deux scalpels. Gardez les morceaux de rognon hachés humides à l’aide de 1 à 2 ml de HBSS.
- Placez les morceaux de rognon hachés sur un tamis métallique de 300 μm et passez le rein à travers le tamis à l’aide d’un piston d’une seringue de 20 ml. Rincez à plusieurs reprises le tamis avec du HBSS entre les deux et recueillez le flux dans une boîte de Pétri propre à l’aide d’une pipette sérologique. Récupérez également tout ce qui reste/colle à la face inférieure du tamis en le grattant avec le scalpel et transférez-le dans le flux collecté (homogénat de rein).
- Rincer l’homogénat du rein à l’aide d’un tamis de 75 μm avec HBSS. Récupérez le flux et rincez-le ensuite à l’aide d’un tamis de 53 μm. Lavez les deux tamis à l’aide d’un HBSS pour éliminer toutes les petites structures.
note: Dans cette étape, le flow-through est uniquement rincé mais pas pressé à travers les tamis de 75 μm et 53 μm. Le lavage avec HBSS est nécessaire pour éliminer les débris et les petites structures sur les tamis. Par conséquent, 200 à 300 ml de HBSS sont normalement utilisés au total.
- Recueillir les structures/matériaux rénaux qui restent sur le tamis de 75 μm et 53 μm en lavant la surface supérieure des tamis avec du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 20 % de sérum de veau fœtal (FCS) et transférer le matériel dans une microplaque à 6 puits à très faible fixation.
note: Pour laver la surface supérieure du tamis, rincez le tamis en position inclinée (>45°) et récupérez la matière rénale au bord du tamis. Le matériel collecté est enrichi en glomérules encapsulés et décapsulés, ne montrant que quelques fragments tubulaires. Les glomérules encapsulés sont très collants. Pour prélever des glomérules uniques, il est donc important d’empêcher les glomérules d’adhérer à la surface d’une boîte de Pétri ou d’une plaque de puits. Pour éviter l’adhérence, utilisez un milieu avec 20 % de FCS et utilisez des plaques de fixation à très faible teneur pour cette étape.
3. Culture de l’excroissance glomérulaire
- Approchez la microplaque à très faible niveau de fixation d’un microscope à lumière inversée et prélevez des glomérules encapsulés et/ou décapsulés à l’aide d’une pipette de 20 μL. Évitez de pipeter d’autres structures et débris. Après avoir recueilli un seul glomérule dans la pointe de la pipette, ajoutez du milieu DMEM frais sans matériel rénal collecté dans la même pointe de pipette jusqu’à un volume de 20 μL.
- Transférez le glomérule unique avec le milieu DMEM de 20 μL au centre d’un puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incubez pendant 3 h à 37 °C et 5 % (v/v) de CO2 pour permettre la fixation du glomérule au centre du puits. Déplacez délicatement la plaque pour éviter que le glomérule ne flotte sur les bords du puits.
- Après 3 h d’incubation, le glomérule est attaché au centre du puits. Ajouter avec précaution 500 μL de milieu basal endothélial (EBM) complété par une trousse de facteurs de croissance contenant de l’hydrocortisone, du facteur de croissance endothéliale humain, de l’extrait de cerveau bovin et du sulfate de gentamicine-amphotéricine B (tableau des matériaux) et 5 % (v/v) de FBS et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine (pen/streptomycine) supplémentaires dans chaque puits.
- Cultiver les glomérules uniques pendant 6 jours à 37 °C, 5 % (v/v) CO2.
REMARQUE : Dans les 6 jours, l’excroissance constituée de cellules épithéliales pariétales se forme. Si l’on vise à tester les effets de composés ou de médicaments spécifiques sur les cellules épithéliales pariétales, il faut l’ajouter au milieu dans cette période de 6 jours.
