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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Implantation de la tumeur
REMARQUE : Chaque souris est implantée avec 1 x 10 cellules5 MB49-PSA dans 50 μL de milieu vierge DMEM dans la vessie. En raison de l’espace mort dans le cathéter, préparez toujours un volume supplémentaire (au moins 100 μL supplémentaire par souris). Une autre approche serait d’utiliser une seringue remplie d’air.
- Cellules
- Un jour avant l’implantation, lorsque les cellules sont confluentes à environ 80 %, faites passer les cellules tumorales MB49-PSA dans un milieu DMEM complet (complété par 10 % de FBS, 2 mmol/L de L-glutamine, 0,05 mg/mL de pénicilline-streptomycine et 200 μg/mL d’hygromycine B) à 37 °C et 5 % de CO2 dans un rapport de division de 1:2.
- Le jour de l’intervention, récoltez les cellules en les grattant doucement à l’aide d’un grattoir à cellules stériles. Mélangez des volumes égaux de suspension cellulaire et une solution de bleu de trypan à 0,4 %. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre. Ne pas implanter si plus de 20 % des cellules sont mortes.
- Calculez le nombre de cellules vivantes nécessaires (2 x 106 cellules/mL) et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Remettez en suspension la pastille de cellule dans un support vierge DMEM. Répétez le lavage trois fois pour éliminer toute trace de FBS avant l’implantation.
- Gardez la suspension cellulaire sur de la glace jusqu’à ce que les souris soient prêtes pour l’implantation.
- Laissez les souris femelles C57BL/6J de 4 à 6 semaines s’acclimater pendant une semaine avant l’intervention. Tous les travaux sur les animaux doivent être effectués dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles.
- Peser chaque souris et injecter un anesthésique (75 mg/kg de kétamine et 1 mg/kg de médétomidine) par voie intrapéritonéale à raison de 0,1 mL par 10 g de poids corporel. Le poids corporel doit être compris entre 17 et 22 g. Confirmez l’anesthésie en n’observant aucune réponse après un pincement de l’orteil.
- Pour l’identification, marquez l’oreille à l’aide d’un poinçon d’oreille.
- Injecter la solution de Hartmann ou le composé de lactate de sodium par voie intrapéritonéale à raison de 0,1 mL par 10 g de poids corporel toutes les 1 à 2 h pour l'hydratation.
- Appliquez une pommade ophtalmique stérile sur les deux yeux à l’aide d’un bulbe de coton stérile, car le réflexe de clignement est perdu sous anesthésie et les yeux se dessèchent. Réappliquez si nécessaire.
- Allongez les souris en position couchée sur des serviettes en papier sur une compresse chauffante (activée par le contact avec l’air) pour maintenir la température corporelle et fixez les pattes arrière avec du ruban adhésif.
- Avec un doigt, appliquez une légère pression sur la région abdominale inférieure et recueillez l’urine de la vessie dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Cet échantillon sert de valeur basale du PSA urinaire.
- Prélever la poly-L-lysine (PLL) stérile dans une seringue de 1 mL et fixer un cathéter IV de calibre 24, avec le stylet de l’aiguille retiré. Appliquez du lubrifiant sur l’extrémité du cathéter et insérez le cathéter à travers l’urètre dans la vessie à l’aide d’une pince pour guider le cathétérisme. Arrêtez-vous lorsque la résistance se fait sentir.
REMARQUE : Les chercheurs doivent discuter avec leur personnel vétérinaire de la nécessité d’utiliser un gel lubrifiant avec anesthésique pour les instillations intravésicales et de l’utilisation d’analgésiques après l’intervention.
- Instillez lentement 50 μL de LPL, à raison de 10 μL toutes les 20 s, pour éviter le reflux vésico-urétéral. Laissez le cathéter dans la vessie pendant 20 minutes avec un bouchon pour éviter l’écoulement.
- Après 20 min, retirez le cathéter et libérez la vessie de tout contenu en appuyant doucement sur la région abdominale inférieure. À l’aide d’une seringue vide de 1 ml, rincer le contenu restant du cathéter.
- Mélangez soigneusement les cellules MB49-PSA par pipetage et retirez-les dans une seringue de 1 ml. Fixez le cathéter et appliquez du lubrifiant. Instillez 50 μL de 1 x 105 cellules à un rythme lent de 10 μL toutes les 20 s. Replacez le bouchon du cathéter. Donnez aux souris témoins 50 μL de solution saline.
- Après 1 h, retirez les cathéters et libérez la vessie de tout contenu. Retirez le ruban adhésif sur les pattes arrière et placez les souris sur leurs côtés ventraux. Réanimer les souris en injectant par voie sous-cutanée le médicament d’inversion (1 mg/kg d’atipamezole) à raison de 0,1 mL par 10 g de poids corporel.
- Surveillez les souris jusqu’à ce que la motilité soit observée. Remettez les souris dans leurs cages.