Administration de plasmides d’ADN dans l’urothélium de la vessie de souris : une procédure basée sur l’électroporation pour administrer efficacement des plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de la vessie murine afin de générer des modèles génétiquement modifiés

Résumé

Source : Chuan, Y. et al. Nouvelle méthode d’administration de l’ADN plasmidique à l’urothélium de la vessie de souris par électroporation. J. Vis. Exp.(2018)

Cette vidéo démontre l’administration du plasmide d’ADN dans l’urothélium de la vessie de souris à l’aide d’une combinaison de techniques de cathétérisme urétral et d’électroporation. La procédure décrite permet de générer des modèles de cancer de la vessie chez la souris.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des plasmides et des outils

1. Pour chaque vessie à transfecter, préparez au moins 20 μL de plasmide d’ADN (1 μg/μL).
2. Ajouter 1 μL de Trypan Blue aux 20 μL de solution plasmidique dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Pipette pour bien mélanger.
3. Autoclavez tous les instruments chirurgicaux et stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Vaporisez fréquemment les instruments chirurgicaux et les gants avec de l’éthanol à 70 % ou utilisez un stérilisateur à billes de verre lorsque vous effectuez les étapes suivantes pour maintenir des conditions stériles.

2. Livraison du plasmide

1. Appliquez de l’éthanol à 70 % sur l’abdomen de souris anesthésié et utilisez un scalpel pour faire une incision verticale de 1 cm pour ouvrir la peau abdominale au-dessus de la vessie.
2. Pipeter au moins 20 μL de solution de plasmide et de Trypan Blue dans l’extrémité externe du cathéter et fixer la seringue.
3. Injectez la solution plasmidique dans la vessie. Si la vessie devient bleue, l’injection est réussie. Laissez un peu de liquide dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.
4. Saisissez l’orifice urétral externe à l’aide d’une pince à épiler, puis retirez le cathéter et la seringue. Utilisez une ficelle pour resserrer l’orifice urétral externe. Faites deux boucles avec la ficelle puis faites deux nœuds.
   note: Le resserrement de l’urètre est important pour prévenir le reflux du liquide plasmidique.
5. Allumez le générateur d’électroporation avec les paramètres suivants : 33 V, temps de travail de 50 ms et temps d’intervalle de 950 ms.
6. Tenez la vessie à l’aide d’une pince à épiler et pincez la vessie avec deux électrodes. Appuyez sur la pédale pour effectuer l’électroporation.
   note: Les impulsions électriques sont réglées pour se produire 5 fois avec de courts intervalles après chaque pression sur la pédale. La souris peut se contracter au cours de ce processus. Appuyer plus d’une fois sur la pédale peut augmenter l’efficacité de l’administration, mais trop d’impulsions électriques peuvent endommager l’intégrité tissulaire de l’urothélium.
   1. Évitez tout contact entre la pince à épiler et les électrodes, car cela générerait une étincelle.

3. Récupération

1. Suturez l’ouverture abdominale et cutanée avec des sutures chirurgicales stériles et des clips. Appliquez de l’iode sur la plaie.
2. Retirer l’animal du système isoflurane. Administrer l’analgésique buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur post-chirurgicale.
3. Gardez l’animal sur le coussin chauffant et remettez-le dans la cage familiale après sa récupération complète. Vérifiez l’animal au moins une fois par jour pour s’assurer qu’il n’a pas de mobilité normale, de comportements d’abreuvement et d’alimentation et qu’il n’y a aucun signe d’infection jusqu’à ce que l’incision soit guérie, puis retirez les pinces. Administrer des injections subséquentes d’analgésique à base de buprénorphine si l’animal présente des symptômes de douleur tels qu’une réduction du toilettage, une agressivité accrue et une vocalisation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue BD 1mL TB	pêcheur	Référence 148232E
Buprénorphine	sigma	B9275-50MG
Pince à épiler Dumont	Roboz Institut chirurgical	RS-5005	Traiter avec de l’éthanol à 70 % avant une utilisation chirurgicale
ECM830 SQ Électroporateur d’ondes	Appareil de Harvard	450052
Cathéters I.V. jetables Exel International Safelet	Fisher Scientific	Tél. : 14 841-21	24G, 2,11 cm de longueur, 0,045 cm de diamètre extérieur
Micro-ciseaux de dissection extra fins	Roboz Institut chirurgical	RS-5135	Traiter avec de l’éthanol à 70 % avant une utilisation chirurgicale
L’isoflurane	Un vétérinaire	501017
K&H Tapis de repos chauffé pour petits animaux, 9 x 12 pouces	amazone		Couvrez le tapis chauffant avec du papier absorbant
Pommade ophtalmique	pêcheur	NC0849514
PBS, pH 7,4	Technologies de la vie	10010049
Pointes de pipette 200 μL	Scientifique américain	Référence 1111-0206
Pointes de pipette, ajustement universel ; 0,1 à 10 μL	pêcheur	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmide CAG-GFP	Addgene	Référence 16664
Pince à épiler platine 5 mm	Appareil de Harvard	450489	5 mm de diamètre
ciseaux	Roboz Institut chirurgical	RS-5880	Traiter avec de l’éthanol à 70 % avant une utilisation chirurgicale
Cordon de ficelle	amazone		Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm cuir couture couture fil ciré plat cordon de ficelle
Ruban, Scotch	pêcheur	19047257
Lubrifiant vétérinaire Therio-gel	PBS santé animale	353 à 736
Teinture Bleu Trypan	Technologies de la vie	15250061
V-1 Anesthésie du système de table	VetEquip	901806
Suture violette Vicryl 18" FS-2 coupe 5-0	pêcheur	NC0578475
Walgreens Povidone Iode 10 %	Walgreens	953982
Clip de plaie	pêcheur	Référence 18045
Applicateur de clip de plaie	pêcheur	1804