Isolement des exosomes : une technique d’ultracentrifugation basée sur la densité utilisant un coussin de saccharose pour séparer les exosomes des milieux conditionnés des cellules en culture

Résumé

Source : Faruqu, F. N. et al. Préparation des exosomes pour l’administration de siRNA aux cellules cancéreuses.J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit une technique d’ultracentrifugation basée sur la densité pour isoler des exosomes à partir de milieux conditionnés récoltés à partir de cultures de cellules rénales embryonnaires humaines à l’aide d’un coussin de saccharose à 25 % (p/p) préparé dans de l’oxyde de deutérium. Les exosomes isolés peuvent être utilisés pour des applications en aval.

Protocole

1. Isolation des exosomes sur un coussin de saccharose

1. Pré-dégagez le média conditionné (CM) récolté par centrifugation différentielle et filtration comme suit.
   1. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube et jeter la pastille. Répétez cette étape de centrifugation une fois de plus, en récupérant le surnageant et en jetant la pastille.
   2. Centrifuger le surnageant à partir de l’étape 1.1. à 2 000 x g pendant 15 min et 4 °C, puis jeter la pastille. Filtrez une fois le surnageant récupéré à travers des filtres de 0,22 μm.
2. Pendant le pré-nettoyage, préparez une solution de saccharose à 25 % (p/p) dans de l’oxyde de deutérium en pesant avec précision 1,9 g (± 0,001 g) de saccharose dans un tube universel, puis en complétant avec de l’oxyde de deutérium jusqu’à ce que le poids atteigne 7,6 g (± 0,001 g).
3. Remplissez un tube d’ultracentrifugation (voir le tableau des matériaux) avec 22,5 mL de CM pré-autorisé. Complétez le CM à 22,5 mL avec du PBS filtré à 0,22 μm si le volume actuel est inférieur à cela.
4. Placez une pipette en verre (voir le tableau des matériaux) dans le tube et, à travers celle-ci, ajoutez 3 ml de solution de saccharose de sorte que la solution forme une couche distincte sous le CM.
5. Placez avec précaution le tube contenant la solution de CM/saccharose en couches dans le godet d’un rotor pivotant (voir le tableau des matériaux) et fixez le godet dans le rotor.
6. Placez le rotor dans l’ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) et faites-le tourner à 100 000 x g pendant 1,5 h à 4 °C.
7. Prélevez 2 ml de la couche de saccharose et ajoutez-la dans un flacon d’ultracentrifugation (voir le tableau des matériaux) contenant 20 ml de PBS filtré pour une étape de lavage.
8. Placez les tubes dans un rotor à angle fixe (voir tableau des matériaux) et faites tourner à 100 000 x g pendant 1,5 h à 4°C.
9. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL et remettre la pastille en suspension avec du PBS filtré de 400 μL. Conservez ce stock d’exosomes à 4 °C ou -80 °C pour un stockage à court et à long terme, respectivement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
saccharose	Fisher Scientific	S/8600/60	1 kg
Oxyde de deutérium (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	250 grammes
1X Saline tamponnée au phosphate	Thermo Fisher Scientific	10010015	500 ml
Millex-GP Unité de filtre à seringue 0,22 μm	Millipore	SLGP033RS
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-80
Rotor pivotant	Beckman Coulter	SW45 Ti
Rotor à angle fixe	Beckman Coulter	Type 70 Ti
Tubes à ultracentrifuger	Beckman Coulter	355631	Polycarbonate. Remplissage max. 32 ml
Flacons d’ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate. Remplissage min. 16 ml, remplissage max. 25 ml
centrifugeuse	Eppendorf	5810R
Pipettes en verre	Fisher Scientific	Référence 1156-6963
25 % p/p coussin de saccharose			Ajouter 1,9 g (± 0,001 g) de saccharose dans un tube universel et compléter avec du D2O jusqu’à ce que le poids atteigne 7,6 g (± 0,001 g). Cela fait ~6 ml du coussin de saccharose à 25 % p/p.