Encapsulation de siRNA dans des exosomes à l’aide de l’électroporation : une technique basée sur des impulsions électriques pour charger des siRNA dans des exosomes

Résumé

Source : Faruqu, F. N. et al. Préparation d’exosomes pour l’administration de siRNA aux cellules cancéreuses. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit une méthode basée sur l’électroporation pour encapsuler des siRNA dans des exosomes. Les exosomes chargés de siRNA peuvent ensuite être utilisés pour des applications thérapeutiques.

Protocole

1. Encapsulation des siRNA dans les exosomes par électroporation

1. Pré-refroidissez la cuvette d’électroporation (voir le tableau des matériaux) sur de la glace pendant 30 min avant l’électroporation.
2. Mélangez 7,0 μg d’exosomes (32 μL à partir de 7 x 10¹² p/mL dans du PBS) avec 0,33 μg de siRNA (12 μL à partir de 2 μM dans de l’eau sans RNase) dans le tube de la microcentrifugeuse. Augmenter le volume à 150 μL avec un tampon d’acide citrique (voir le tableau des matériaux). Le rapport molaire exosome/siRNA est de 1:60 dans ce cas.
3. Transférer le mélange dans la cuvette d’électroporation. Boucher la cuvette et la placer dans le support de cuvette de l’électroporateur (voir tableau des matériaux). Tournez la roue tournante de 180° dans le sens des aiguilles d’une montre.
   note: La roue doit être complètement tournée en position verrouillée, afin que la cuvette entre en contact avec les électrodes.
4. Sélectionnez le programme d’électroporation souhaité (par exemple, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) et démarrez l’électroporation en appuyant sur le bouton de démarrage.
   note: Une impulsion réussie est indiquée par l’affichage de « OK » sur l’écran.
5. Une fois électroporée, retirez la cuvette après avoir tourné la roue de 180° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Prélever l’échantillon de la cuvette à l’aide de la pipette en plastique pour un traitement ultérieur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Atto655-siRNA	Eurogentec	SQ-SIRNA	(Labellisé-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55 ; (Non étiquetéCOMME) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
Pipettes en verre	Fisher Scientific	Référence 1156-6963
Amaxa Nucleofector I	Lonza	Nucleofector I	Avec les kits Nucleofector d’Amaxa
Tampon d’acide citrique avec EDTA			Mélanger 0,1954 g d’acide citrique et 0,2087 g de phosphate disodique dans 50 ml d’eau déminéralisée. Ajouter l’EDTA à 0,1 mM. Ajustez le pH à 4,4.
Tubes microfuges	Starlab	Réf. S1615-5500	1,5 ml