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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Traitement tissulaire et isolement de cellules tubulaires primaires
- Retirez les gélules rénales et la moelle, coupez les deux reins en petits morceaux et incuberez-les dans 10 ml d’un tampon de digestion dans un four à 37 °C avec rotation douce pendant 5 min.
- Éliminez tous les tissus rénaux non digérés en passant le tampon à travers un filtre de 70 μm. Ajouter 10 ml de milieu de culture pour arrêter la digestion.
- Pour prélever les cellules tubulaires, centrifuger la suspension de cellules filtrées à 50 x g pendant 5 min pour recueillir la première pastille. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et ajoutez 5 mL de milieu de culture, centrifugez-le à 50 x g pendant 5 min pour vous assurer que toutes les cellules tubulaires sont collectées dans la deuxième pastille. La centrifugation se fait à une vitesse inférieure pour traiter principalement les tubules lourds. Plus tard, une fois que les cellules se sont remises de l’isolement, la culture tubulaire pure est centrifugée à une vitesse plus élevée pendant les sous-cultures.
- Remettre la première pastille en suspension dans 20 mL de milieu de culture et la centrifuger à 50 x g pendant 5 min pour recueillir la troisième pastille.
- Remettre en suspension les deuxième et troisième granules dans 1 mL de milieu de culture. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de Trypan Blue, chargez le mélange dans la chambre A d’une lame de comptage et enregistrez la viabilité de la cellule à partir du compteur automatique de cellules.
- Ensemencez jusqu’à 10à 7 cellules (une population hétérogène) dans une seule boîte de 60 mm pré-enrobée de collagène et laissez les cellules tubulaires se fixer pendant la nuit.