Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Réaliser la chirurgie d’injection hydrodynamique du bassinet du rein
- Choisissez soigneusement les souris pour la chirurgie.
REMARQUE : Aucune différence spécifique à la souche n’a encore été observée, mais cela pourrait être possible. La plupart des injections ont été effectuées sur les arrière-plans C57BL/6 ou FVB. Les injections du bassinet du rein fonctionnent mieux chez les souris âgées de 6 à 12 semaines. Chez les souris de plus de 16 semaines, un taux d’échec allant jusqu’à 50 % par imagerie de la luciférase est possible pour des raisons peu claires. Le même taux d’échec lié à l’âge a été observé pour les injections hydrodynamiques de la veine caudale dans le foie, de sorte qu’il peut s’agir d’une limitation générale liée au principe de l’injection hydrodynamique. Dans le même ordre d’idées, d’autres ont montré que l’injection hydrodynamique de la veine de la queue dans le foie fibrotique du rat n’est pas aussi efficace que le foie sain, de sorte qu’il est possible que dans les contextes de fibrose rénale, l’injection hydrodynamique du bassinet du rein ne soit pas aussi efficace, mais cela n’a pas été testé directement.
2. Préparer les souris et les seringues à ADN pour la chirurgie
- Anesthésier les souris avec de la kétamine et de la xylazine.
- Mettez l’équipement de protection individuelle approprié requis par l’animalerie, comme un tablier de laboratoire jetable, un masque chirurgical et des gants en nitrile.
- En travaillant avec 2 à 4 souris à la fois, pesez chaque souris dans un bécher en plastique de 500 ml sur une balance précise à 0,1 g. Calculez la quantité correcte de 24 mg/mL de kétamine et de 2 mg/mL de xylazine diluée dans une solution saline normale à 0,9 % à administrer à chaque souris par injection intrapéritonéale (voir la vidéo référencée pour plus d’informations sur l’injection intrapéritonéale). Utilisez la formule (50 μL + ((5 μL) x (poids(g))), ou calculez selon une autre formule après consultation de l’équipe vétérinaire locale et de l’IACUC.
- Injecter la souris par injection intrapéritonéale selon des techniques standard. Placez la souris dans un seau en papier jusqu’à ce qu’elle soit immobile.
REMARQUE : Les souris sont prêtes pour la chirurgie lorsqu’elles ne répondent plus au test de pincement des orteils. Donnez aux souris qui continuent de répondre au test de pincement des orteils 20 à 30 minutes après l’injection initiale 20 à 60 μL d’anesthésique supplémentaire, selon la force de la réponse.
- Placez la souris sur un coussin chauffant à circulation d’eau recouvert d’un coussin bleu et placez une pommade vétérinaire dans les deux yeux pour prévenir la dessiccation de la cornée.
- Rasez le côté gauche du dos de la souris de l’épaule à la croupe et du flanc à la colonne vertébrale avec un rasoir conçu pour le toilettage des animaux. Enlevez les cheveux et les débris.
- Préparez une seringue distincte contenant 100 μL d’ADN dilué pour chaque souris anesthésiée, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air.
- Utilisez une seringue à insuline U-100 stérile de 29G x 1/2" 0,5 ml avec une aiguille fixée en permanence sans dispositif de sécurité.
REMARQUE : Le type de seringue est d’une importance cruciale. Cette jauge permet une injection rapide. L’aiguille fixée en permanence empêche la solution de s’échapper. La présence de sécurité entravera l’accès au bassinet du rein. Les seringues spécifiées dans le tableau des matériaux glissent plus uniformément pendant l’injection que les autres marques testées.
- Chargez la seringue à ~120 μL et tirez le piston vers le bas pour créer un espace en haut. Tapotez avec un stylo jusqu’à ce que toutes les bulles d’air montent vers le haut. En tenant l’aiguille vers le haut, appuyez doucement sur le piston pour évacuer tout l’air jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme à la pointe de l’aiguille. Il ne doit pas y avoir de bulles visibles, car elles peuvent provoquer une embolie gazeuse qui tuera l’animal.
- Terminez d’enfoncer le piston jusqu’à ce qu’il y ait 100 μL dans la seringue en vidant l’excès de solution d’ADN dans le tube de microfuge d’origine. Étiquetez soigneusement si nécessaire et placez les seringues chargées sur un champ stérile pour maintenir la stérilité si l’installation où le travail est effectué ne permet pas le rebouchage des aiguilles.
3. Effectuer une chirurgie d’injection
- Préparez le site pour la chirurgie. Placez un champ stérile sur le coussin chauffant et videz les outils chirurgicaux stériles sur le champ stérile sans les toucher. Prenez la souris et placez-la dans le champ de vision. Ajustez l’éclairage pour éclairer la zone.
- Retirer trois tampons d’antiseptique cutané à 3,15 % de gluconate de chlorhexidine et d’alcool isopropylique à 70 % de l’emballage et les placer près de l’animal.
- Enfilez des gants chirurgicaux stériles. En effectuant un mouvement circulaire en commençant au site d’incision, frottez l’animal avec un nouvel écouvillon de chlorhexidine / alcool trois fois.
- Localisez le site de l’incision comme illustré à la figure 1A. En pinçant la peau avec une pince à épiler, utilisez des ciseaux pour faire une incision dans la couche de peau à environ 1 cm de la colonne vertébrale et sous la cage thoracique. Une fois que le site de coupe mesure environ 1 cm de long, faites un site de coupe similaire ci-dessous, dans la couche musculaire.
REMARQUE : Faites l’incision à la bonne longueur pour permettre au rein de passer à peine à travers l’incision, puis d’être maintenu en place par l’incision elle-même. Une incision trop petite et le rein ne peut pas être exposé ; Trop gros et le rein glissera continuellement dans la cavité abdominale.
- Localisez le kidney.
note: Il peut être visible parmi le tissu adipeux blanc. La rate est également située sur le côté gauche de l’animal. La couleur de ces organes peut être différenciée visuellement, car la rate est d’un marron foncé tandis que le rein est d’un rouge-orange foncé. Il n’est pas souhaitable de manipuler la rate car elle peut être facilement rompue.
- Sans toucher le rein, exposez-le doucement de la cavité abdominale en exerçant une pression constante et douce sur l’abdomen avec les doigts (figure 2C). Utilisez une pince à épiler fermée pour repousser doucement les organes indésirables dans l’abdomen si nécessaire. N’utilisez pas de pinces ouvertes car cela pourrait endommager les reins ou d’autres organes.
- Une fois que le rein est sorti de l’abdomen, séparez-le doucement de la graisse environnante juste assez pour visualiser le bassinet du rein, un petit point blanc (Figure 1B). Poussez l’excès de graisse d’un côté ou retirez-le si nécessaire. Assurez-vous de ne pas retirer la glande surrénale, située près du pôle supérieur du rein, ou la capsule rénale.
- À l’aide d’une pince fermée pour appuyer sur le côté droit du rein afin que le bassinet du rein reste en vue, saisissez la seringue à insuline chargée avec la main droite et maintenez-la parallèlement à la surface de travail avec l’aiguille pointée vers le bassinet du rein (figure 2E). Insérez l’aiguille avec précaution dans le bassinet du rein immobilisé comme indiqué sur la figure 1B.
- Injectez la solution rapidement dans les trois secondes. Environ un tiers du rein peut s’éclaircir et virer au blanc.
REMARQUE : Il est courant d’observer une accumulation de liquide dans la capsule rénale après l’injection ainsi que la formation d’un hématome. Certains dommages sont nécessaires pour atteindre un niveau suffisant de transfection de l’ADN pour la détection.
- Maintenez l’aiguille en place pendant environ 10 secondes pour éviter le reflux de la solution. Ensuite, retirez soigneusement et lentement l’aiguille. Remettez l’organe dans la cavité abdominale en étirant doucement le site d’incision et en utilisant des pinces fermées.
- Suturez la couche musculaire de l’animal avec 5-0 sutures résorbables, en plaçant 2 à 4 nœuds indépendants.
- Suturez la couche cutanée de l’animal avec des sutures en nylon non résorbables 5-0 ou 6-0, en plaçant 2 à 4 nœuds indépendants.
REMARQUE : Les outils chirurgicaux peuvent être réutilisés après avoir été placés dans un bain de billes stériles et refroidis.
