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1. Implantation des cellules
Pour implanter des cellules Renca par voie intrarénale, préparez des cellules Renca dans une suspension unicellulaire à raison de 2 x 106 cellules/mL dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
- Retirer les cellules Renca adhérentes du flacon de culture tissulaire à l’aide de la trypsine à 0,25 % dans le HBSS. Après ~5 min, ajoutez du RPMI complet dans le ballon pour neutraliser la trypsine et transférez les cellules dans un tube à centrifuger pour le lavage. Centrifuger les cellules à une force centrifuge de 300 g relative (rcf x g) pendant 5 min à 25 °C.
- Décantez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans HBSS. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez le volume avec HBSS pour obtenir un résultat de 2 x 106 cellules/mL.
- Aspirez les cellules dans une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de calibre 18 pour éviter le stress de cisaillement sur les cellules. Remplacez l’aiguille de calibre 18 par une aiguille de calibre 28 avant l’injection des cellules tumorales. Une injection de 0,1 mL délivre 2 x 105 cellules dans le rein.
2. Préparation de la zone chirurgicale
- Préparez une zone chirurgicale stérile dans une enceinte de biosécurité en plaçant un champ chirurgical stérile sur un coussin chauffant. Rassemblez toutes les fournitures, y compris des pinces, un scalpel, des ciseaux, des gouttes ophtalmiques, un antiseptique à base de povidone iodé à 5 % et de la gaze stérile. Autoclavez tous les instruments avant de les utiliser.
- Effectuez la chirurgie en utilisant une technique de pointe aseptique. Restérilisez les instruments entre les animaux à l’aide d’un stérilisateur à billes. Portez des gants stériles, une blouse de laboratoire et un masque facial.
3. Préparation des animaux
- Anesthésier les souris avec de la kétamine/xylazine (87,5 mg/kg et 12,5 mg/kg, respectivement, i.p.) conformément aux directives de l’établissement. Déterminez la profondeur de l’anesthésique en effectuant un pincement des orteils.
- Lorsque l’animal est considéré comme non réceptif, préparez le point d’injection (p. ex. flanc gauche) sur les souris Balb/c en plumant (avec les doigts) ou en rasant (à l’aide d’une tondeuse) la fourrure.
- Déplacez les souris de la zone de préparation à la chirurgie (par exemple, la cage de logement) vers la zone chirurgicale et appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Frottez généreusement le site d’incision préparé avec un antiseptique à la povidone iodée à 5 %.
- Injectez du chlorhydrate de bupivacaïne (0,1 mL d’une solution à 2,5 mg/mL, s.c.) dans la zone où l’incision sera pratiquée comme analgésie préopératoire.
- Faites une incision unique (~1,0 à 1,5 cm) sur le flanc gauche de l’animal à l’aide d’un scalpel stérile ou de ciseaux avec précaution afin de ne pas pénétrer le péritoine. Séparez le derme du péritoine avec des ciseaux stériles. Tamponnez le site d’incision avec de la gaze de coton stérile pour éliminer tout sang.
- Tenez la souris à deux mains, en utilisant la main gauche pour tenir la tête et la main droite pour soutenir le flanc.
- Identifiez la rate à travers le péritoine et, avec un doigt de la main droite, palpez la souris par le dessous ; le rein devrait maintenant être visible à travers le péritoine. Gardez une prise ferme sur l’animal pour fournir une tension sur le péritoine et les reins.
- Demandez à une deuxième personne d’injecter les cellules tumorales (préparées à la section 1.2) à travers le péritoine intact au centre du rein à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille de calibre 28. Administrer lentement 0,1 mL (2 x 105) de cellules. Une fois les cellules injectées, maintenez l’aiguille en place pendant 5 à 10 secondes pour réduire le reflux des cellules. Il est important de noter qu’il faut faire preuve d’une extrême prudence au cours de cette étape, car la personne qui injecte les cellules amènera l’aiguille à proximité des doigts de la personne qui tient la souris.
- Retirez l’aiguille et fermez l’incision avec une fine couche d’adhésif pour tissu cyanoacrylate.
- Remettez l’animal dans une cage propre avec une serviette en papier stérile. Laissez les animaux récupérer sur un coussin chauffant. Ne laissez pas les animaux sans surveillance pendant la période de récupération. Ne remettez pas les animaux dans des conditions de logement standard tant qu’ils ne sont pas debout et sternaux. Suivre les directives de l’établissement dans toutes les procédures utilisant des animaux de laboratoire.