Analyse de l’expression des protéines basée sur des réseaux de protéines en phase inverse : une procédure de quantification simultanée de l’expression de plusieurs protéines à partir d’un lysat cellulaire

Résumé

Source : O'Mahony, F. C. et al. L'utilisation des réseaux de protéines en phase inverse (RPPA) pour explorer la variation de l'expression des protéines au sein des cancers individuels des cellules rénales. J. Vis. Exp. (2013)

Cette vidéo présente la méthodologie utilisée pour réaliser des réseaux de protéines en phase inverse (RPPA) afin d’étudier les modèles d’expression des protéines à partir du lysat cellulaire. Dans le RPPA, le lysat contenant un mélange de protéines est imprimé sur des lames de nitrocellulose et les protéines d’intérêt sont analysées à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence.

Protocole

1. Impression RPPA

1. Des lysats de protéines ont été repérés sur des lames de verre recouvertes de nitrocellulose (Fastslides-Whatman) à l’aide d’un observateur robotique MicroGrid II. Les lames utilisées contenaient 2 pastilles sur lesquelles les échantillons ont été repérés. Chaque tampon a été repéré avec des échantillons identiques, dans ce cas, 100 échantillons. Les autres formats disponibles incluent des diapositives de 1, 8 et 16 pads. Plus le nombre de tampons est élevé, plus le nombre d’échantillons qui peuvent être repérés sur chacun d’eux est petit.
2. Une série de cinq dilutions 2 fois a été effectuée à partir de chaque éc....

Résultats

Figure 1. Schéma de déroulement du processus de balayage RPPA.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Triton X-100	Triton-X	Réf. T8787
Tampon de blocage Li-Cor Odyssey	Li-Cor	Référence 927-40000
Observateur robotique MicroGrid II	Biorobotique
Support de glissière à quatre baies de FastFrame	Whatman	10486001
Glissière FAST - 2 pads	Whatman	10485317
IRDye 680LT Chèvre anti-Souris IgG	Licor	Référence 926-68020
IRDye 800CW Chèvre anti-Lapin IgG	Licor	Référence 926-32211