Analyse de l’expression des protéines basée sur des réseaux de protéines en phase inverse : une procédure de quantification simultanée de l’expression de plusieurs protéines à partir d’un lysat cellulaire

Abstract

Source : O'Mahony, F. C. et al. L'utilisation des réseaux de protéines en phase inverse (RPPA) pour explorer la variation de l'expression des protéines au sein des cancers individuels des cellules rénales. J. Vis. Exp. (2013)

Cette vidéo présente la méthodologie utilisée pour réaliser des réseaux de protéines en phase inverse (RPPA) afin d’étudier les modèles d’expression des protéines à partir du lysat cellulaire. Dans le RPPA, le lysat contenant un mélange de protéines est imprimé sur des lames de nitrocellulose et les protéines d’intérêt sont analysées à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence.

Protocol

1. Impression RPPA

1. Des lysats de protéines ont été repérés sur des lames de verre recouvertes de nitrocellulose (Fastslides-Whatman) à l’aide d’un observateur robotique MicroGrid II. Les lames utilisées contenaient 2 pastilles sur lesquelles les échantillons ont été repérés. Chaque tampon a été repéré avec des échantillons identiques, dans ce cas, 100 échantillons. Les autres formats disponibles incluent des diapositives de 1, 8 et 16 pads. Plus le nombre de tampons est élevé, plus le nombre d’échantillons qui peuvent être repérés sur chacun d’eux est petit.
2. Une série de cinq dilutions 2 fois a été effectuée à partir de chaque échantillon, puis chacune a été repérée en trois exemplaires (ce qui a donné un total de 15 points par échantillon).

2. Détection de la protéine RPPA

1. Lames mouillées dans l’excès de tampon bloquant LiCor (dilué 50:50 dans PBS). Incuber à RT pendant 1 heure sur une plate-forme basculante.
2. Préparez 800 μL d’anticorps primaires dans le tampon bloquant LiCor (dilué 50:50 dans du PBS) aux concentrations souhaitées et conservez-le sur de la glace.
3. Montez les lames dans (i) le clip à puce à cadre unique ou (ii) le support de diapositives à quatre baies « FastFrame » de manière à ce qu'un joint étanche se forme entre la lame et la chambre d'incubation.
4. Retirer le tampon résiduel des puits et ajouter 600 μL d’anticorps primaires dans les puits respectifs.
5. Placez la lame et la chambre dans une boîte humide scellée et incubez sur une plate-forme à bascule pendant la nuit à 4 °C.
6. Compléter 0,1 % de PBS-Tween20 (PBS-T ; 100 μL Tween 20/100 mL PBS).
7. Retirez les lames de la chambre froide et retirez soigneusement les anticorps primaires de chaque puits.
8. Ajouter 600 μL de PBS-T et laver les lames sur la plate-forme basculante à RT pendant 5 min (X3).
9. Préparez des anticorps secondaires marqués par fluorescence en les diluant dans le tampon bloquant Odyssey (dilué 50:50 dans le PBS) à 0,01 % SDS à une dilution de 1:2 000 (1 μL/2 mL) dans un premier temps.
10. Retirez le tampon des puits et ajoutez 600 μL d’anticorps secondaires marqués par fluorescence dans les puits respectifs. Incuber les anticorps secondaires à température ambiante pendant 45 minutes en les secouant doucement ; Il est important de protéger la membrane de la lumière jusqu’à ce qu’elle ait été finalement scannée.
11. Retirer les anticorps secondaires du puits et laver brièvement (x3) dans 600 μL de PBS-T à température ambiante. Retirez la lame du support, transférez-la dans un récipient approprié et lavez-la dans l’excès de PBS-T pendant 15 min, en gardant la membrane dans l’obscurité.
12. Retirez le PBS-T et lavez davantage la membrane avec du PBS à température ambiante pendant 15 minutes pour éliminer les résidus de Tween-20, en gardant à nouveau la membrane dans l’obscurité.
13. Faites sécher le Fastslide dans un four à 50 °C pendant 10 min, puis numérisez sur le scanner Li-Cor Odyssey. Gardez la diapositive dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elle ait été numérisée.
14. Scannez la lame à 680 nm et/ou 800 nm en fonction de l’anticorps secondaire ou des anticorps utilisés. Pour la détection bicolore, utilisez toujours des anticorps secondaires fortement adsorbés afin de minimiser la réactivité croisée. Une sélection minutieuse des anticorps primaires et secondaires est nécessaire pour la détection bicolore. La sélection de différentes espèces hôtes (par exemple le lapin et la souris) pour les deux anticorps primaires est d’une importance primordiale. Cela permet une discrimination par des anticorps secondaires anti-lapin et anti-souris qui sont marqués avec un colorant avec des spectres d’émission facilement distinguables.
15. Les fichiers image sont enregistrés en tant que fichiers .tiff. La figure 1 représente l’image des fichiers numérisés.

Results

Figure 1. Schéma de déroulement du processus de balayage RPPA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triton X-100	Triton-X	Réf. T8787
Tampon de blocage Li-Cor Odyssey	Li-Cor	Référence 927-40000
Observateur robotique MicroGrid II	Biorobotique
Support de glissière à quatre baies de FastFrame	Whatman	10486001
Glissière FAST - 2 pads	Whatman	10485317
IRDye 680LT Chèvre anti-Souris IgG	Licor	Référence 926-68020
IRDye 800CW Chèvre anti-Lapin IgG	Licor	Référence 926-32211