Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des solutions
- Préparez une solution mère 50x de milieu embryonnaire E3 en mélangeant 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 et 9,95 g de MgSOdans 5 L d’eau distillée, et conservez-la à RT.
- Préparez une solution mère 50x de milieu embryonnaire E3 en mélangeant 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 et 9,95 g de MgSOdans 5 L d’eau distillée, et conservez-la à RT.
- Pour l’élevage d’embryons de poisson-zèbre, diluer la solution mère 50x de milieu embryonnaire E3 dans une solution de travail 1x avec de l’eau distillée, puis ajouter 200 μl de bleu de méthylène à 0,05 % à chaque 1 L de 1x E3 pour agir comme fongicide, et stocker à RT.
- Préparez une solution de blocage de la pigmentation à partir d’un milieu embryonnaire E3 contenant 0,003 % de 1-phényl-2-thiourée (PTU) en combinant 40 ml de la substance 50x E3 avec 0,06 mg de PTU. Portez ensuite le volume à un total de 2 L avec de l’eau distillée.
- Mélangez l’E3/PTU O/N à RT pour obtenir la poudre PTU en solution. Ensuite, stockez l’E3/PTU sur RT.
note: L’E3/PTU a une durée de conservation d’environ une semaine, et les solutions plus anciennes seront moins efficaces pour bloquer le développement de la pigmentation chez les larves de poisson-zèbre.
- Préparez une solution anesthésique de tricaïne à 0,2 % (MS-222) en ajoutant 1 g de tricaïne à 500 ml d’eau distillée et ajustez le pH à 7,2 avec 1 M de Tricaïne, pH 9,5.
2. Préparation des outils
- Préparez un outil de manipulation d’embryons, utilisé pour positionner les embryons pour la microinjection, en fixant une pointe de chargement de gel à l’extrémité d’une aiguille de dissection droite de 5 pouces, et fixez-la avec du ruban adhésif ou de la superglue.
- Préparez les aiguilles de micro-injection à l’aide d’un extracteur d’aiguille, en plaçant d’abord un verre borosilicaté poli au feu de 10 cm avec filament dans l’instrument et fixez le verre borosilicaté en serrant les poignées.
- Tirez sur le verre borosilicaté pour former des aiguilles fines et effilées. Utilisez les paramètres suivants : chaleur 540, traction 245, vitesse 200 et temps 125.
- Placez les aiguilles à l’intérieur d’une boîte de Pétri, en les suspendant sur une bande de pâte à modeler pour protéger les pointes des aiguilles, et gardez le plat couvert pour éviter l’accumulation de poussière.
- Pour terminer la préparation de l’aiguille pour les micro-injections, utilisez une lame de rasoir ou un bord de pince fin pour couper l’extrémité tirée de l’aiguille afin de créer une pointe d’injection angulaire pointue d’un diamètre d’environ 0,05 à 0,1 mm.
- Pour réaliser le plateau de micro-injection, préparer une solution d’agarose/E3 à 1,5 % dans un erlenmeyer de 100 mL et dissoudre l’agarose en chauffant l’E3 à ébullition au micro-ondes, puis laisser refroidir à RT pendant environ 10 min.
- Versez la solution d’agarose/E3 refroidie dans une boîte de Pétri pour faire une fondation d’une profondeur d’environ 0,5 cm. Lorsque celui-ci s’est solidifié, versez une deuxième couche d’une profondeur d’environ 0,3 cm et insérez l’embryon préfabriqué dans un moule et laissez l’agarose se solidifier à RT.
note: Lors de l’insertion du moule dans la couche supérieure de gélose/E3, placez le moule dans la gélose à un angle pour diminuer le nombre de bulles d’air.
- Lorsque tout le plateau de micro-injection a pris, soulevez le moule embryonnaire préfabriqué lentement et soigneusement à l’aide d’une cuillère, puis remplissez le bol de solution E3 et conservez-le à 4 °C.
3. Microinjection de solution de néphrotoxine
- Le jour de l’injection, préparez la solution de néphrotoxine souhaitée avec le contrôle approprié du véhicule.
- Agitez ou mélangez doucement pour vous assurer que le ou les médicaments sont en solution, en vérifiant les côtés du tube et le haut de la colonne d’eau.
note: Des solutions de néphrotoxine peuvent être préparées pour contenir des traces de dextran conjugué par fluorescence afin de surveiller l’efficacité de la micro-injection et d’évaluer la clairance rénale à des moments ultérieurs.
- Chargez une aiguille de micro-injection coupée avec ~2 à 3 μL de néphrotoxine en enfilant une fine pointe de chargement de gel à l’arrière de l’aiguille et suspendez l’aiguille verticalement avec un morceau de ruban adhésif pour permettre à la solution de remplir la pointe de l’aiguille coupée par gravité.
- Une fois que la pointe de l’aiguille est pleine, fixez l’aiguille chargée dans le micromanipulateur.
- Testez le volume de micro-injection en plaçant une goutte d’huile minérale sur une lame micrométrique et injectez-la dans l’huile pour évaluer la taille des gouttelettes. Un volume d’injection de 500 pl a un diamètre de 0,1 mm.
- Retirer la boîte d’embryons de l’incubateur et anesthésier en ajoutant environ 5 ml de tricaïne à 0,2 % dans la boîte à embryons.
- Pour assurer une anesthésie complète, touchez doucement l’embryon avec la pointe de l’outil manipulateur d’embryons. L’absence de mouvement indique une anesthésie suffisante.
- Une fois l’anesthésie réussie, transférez les embryons dans le moule d’injection à l’aide d’une pipette de transfert.
- Manœuvrez chaque embryon dans un puits différent du moule, en plaçant la tête dans la zone la plus profonde du puits de sorte que le tronc repose le long de la dépression et que la queue dépasse de la dépression.
- Insérez l’aiguille remplie dans le micromanipulateur et placez la pointe de l’aiguille à côté d’un embryon.
- Insérez doucement l’aiguille dans le vaisseau de queue en déplaçant le joystick vers l’avant et appuyez sur la pédale pour délivrer la microinjection.
note: Le succès de l’injection peut être évalué en regardant le liquide entrer dans la circulation. De plus, la co-injection du néphrotoxique avec du dextran conjugué par fluorescence permet au chercheur de vérifier l’efficacité de l’injection après la procédure.
- Tirez doucement sur le joystick pour retirer l’aiguille de l’embryon.
- Après l’injection, transférez les embryons dans une boîte propre et rincez-les pour enlever la tricaïne et remplacez-la par de l’E3/PTU frais.
- Incuber l’embryon jusqu’au point temporel souhaité pour évaluer la morphologie, qui peut être documentée par photographie dans des milieux de montage en méthylcellulose, ou par un processus d’analyse expérimentale si désiré.
note: La récupération des embryons doit être évaluée pour déterminer le pourcentage d’individus atteints d’œdème, ce qui indique généralement une lésion rénale.
