Préparation du support plat du rein : une procédure pour disséquer et préparer un support plat pour l’analyse microscopique du rein de poisson-zèbre adulte

Résumé

Source : McCampbell, K. K. et al. Analyse de la composition et de la fonction des néphrons dans le rein du poisson-zèbre adulte.J. Vis. Exp. (2014)

Cette vidéo montre la dissection et la préparation d’un support plat du rein de poisson-zèbre adulte. Le support plat préparé peut être visualisé au microscope pour l’analyse des échantillons.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dissection et montage à plat Préparation du rein de poisson-zèbre adulte à partir d’un échantillon animal non fixé pour visualiser le marquage au dextran fluorescent du tubule proximal

1. Euthanasiez le poisson-zèbre adulte injecté de dextran en le plaçant dans un plat avec 0,2 % de tricaïne pH 7,0 pendant 4 à 5 min
   note: Assurez-vous que le poisson a été euthanasié avant de procéder, en surveillant attentivement si les branchies ont cessé de bouger et si le cœur a cessé de battre.
2. À l’aide d’une cuillère en plastique, retirez le poisson de la solution de tricaïne, décantez la solution et placez l’animal sur un mouchoir ou une serviette en papier.
3. À l’aide d’une paire de ciseaux de dissection bien aiguisés, faites une incision derrière l’opercule branchial et retirez la tête.
4. Ouvrez immédiatement le corps du poisson avec les ciseaux de dissection en faisant une longue incision ventrale de la tête à la base de la nageoire caudale.
5. Retirez les organes internes du poisson à l’aide d’une paire de pinces fines.
6. Utilisez des aiguilles de dissection très fines pour ouvrir les parois du corps afin de permettre la visualisation de l’organe rénal, qui adhère à la paroi dorsale de l’animal.
7. Utilisez des pinces fines pour détacher le rein de la paroi dorsale.
8. Placez délicatement le rein dans un flacon en verre de 5 ml contenant 1X PBS et lavez-le 3 fois avec 3 à 5 ml de 1X PBS frais pendant 5 min chacune.
   note: L’utilisation d’un flacon en verre pour la manipulation d’échantillons de rein adulte facilite la visualisation des tissus et permet des lavages avec de grands volumes (par rapport à la masse tissulaire) d’environ 3 à 5 ml. Alternativement, une boîte de culture cellulaire à 12 puits peut être utilisée. Bien qu’un tube de microcentrifugation en plastique puisse être utilisé, les tubes de taille standard (1,5 ml) pourraient limiter le lavage.
9. Retirez le rein à l’aide d’une pipette de transfert et placez-le sur une lame en verre propre avec 1 à 2 gouttes de 1X PBS.
10. À l’aide d’une pince fine, aplatissez le rein sur la lame, en vous assurant qu’aucun tissu ne s’est recourbé ou renversé sur lui-même.
    note: Alternativement, un outil en fil de tungstène peut être utilisé pour faire de petites incisions dans le tissu conjonctif afin de faciliter le positionnement aplati du rein.
11. Placez de petits morceaux de pâte à modeler sur chaque coin d’une lamelle en verre de 18 x 18 mm et posez lentement la lamelle sur le rein.
    note: Inclinez légèrement la lamelle pendant la mise en place pour minimiser le piégeage des bulles d’air dans la solution. Les mottes en pâte à modeler ont un diamètre d’environ 2 mm (Figure 1A). Alternativement, des divots de graisse sous vide peuvent être substitués à la place de la pâte à modeler. Ajoutez une goutte supplémentaire de 1X PBS pour remplir l’espace entre la lamelle et la lame de verre si nécessaire.
12. Observez et/ou imagez le rein en plaçant la lame de verre dans le champ de vision d’un stéréomicroscope ou d’un microscope composé avec le filtre approprié.

Résultats

Figure 1. Préparation et application du rein de poisson-zèbre adulte pour visualiser l’absorption de dextran conjugué dans le segment PCT des néphrons rénaux. (A)Image en fond clair d’une préparation à montage plat d’un échantillon de rein, dans laquelle l’organe a été positionné à plat sur une lame de verre, avec une lamelle placée sur le tissu qui repose sur quatre divots de pâte à modeler (...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 fois le PBS			Fabriqué en diluant 10 X PBS dans de l’eau distillée.
Pinces fines	Roboz	RS-1050	Pince à épiler Dumont Motif #55
Toboggan en verre	Thermo-Fisher	N° 4445	Givre blanc
Lamelle en verre	Thermo-Fisher	12 à 540 A	18 x 18 millimètre
Pâte à modeler	Hasbro	Playdoh	D’autres pâtes à modeler peuvent être remplacées et fonctionner de la même manière.
Porte-glissière	Thermo-Fisher	Référence 12-587	En option : plateau en carton pour stocker les diapositives à plat.
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ645 ; SMZ1000 ; 83455 P-Bleu GFP/DAPI ; 83457 P-Endow GFP/ FITC ; 83457 P-TRITC	Le jeu de filtres utilisé était le suivant : le filtre Hoechst/DAPI a été utilisé pour la détection du DAPI, de l’iodure de propidium, du bleu en cascade de dextran et de la phosphatase alcaline. Le filtre GFP/FITC a été utilisé pour la détection du dextran-FITC, du dextran lucifer yellow et de l’antiGFP. Le filtre TRITC a été utilisé pour la détection du dextran-fluoro-ruby, du PI et du DBA.
Microscope composé	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI ; 96311 C-FL B-2E/C FITC ; 96313 C-FL Y-2E/C Rouge Texas	Le jeu de filtres utilisé était le suivant : le filtre Hoechst/DAPI a été utilisé pour la détection du DAPI, de l’iodure de propidium, du bleu en cascade de dextran et de la phosphatase alcaline. Le filtre GFP/FITC a été utilisé pour la détection du dextran-FITC, du dextran lucifer yellow et de l’antiGFP. Le filtre Texas Red a été utilisé pour la détection du dextran-fluoro-ruby, du PI et du DBA.