Dépigmentation et précoloration du rein de poisson-zèbre : une technique pour préparer le rein de poisson-zèbre adulte à la coloration

Résumé

Source : McCampbell, K. K. et al. Analyse de la composition et de la fonction des néphrons dans le rein du poisson-zèbre adulte. J. Vis. Exp. (2014)

Dans cette vidéo, nous démontrons la dépigmentation du rein de poisson-zèbre adulte et sa préparation ultérieure pour les procédures de coloration. Après la coloration, le rein de poisson-zèbre adulte peut être utilisé pour étudier la régénération rénale, la caractérisation phénotypique de modèles de maladies rénales et la fonctionnalité du néphron.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Fixation, dissection, perméabilisation et élimination de la pigmentation du rein de poisson-zèbre adulte

1. Préparez une solution fixatrice fraîche de 4 % de paraformaldéhyde (PFA)/1X PBS/0,1 % de DMSO ou décongelez une aliquote congelée de 4 % de PFA/1X PBS et ajoutez 0,1 % de DMSO.
   ATTENTION : Le PFA est toxique et les solutions de PFA doivent être manipulées à l’aide d’une cagoule chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire. De plus, la poudre de PFA doit être manipulée avec précaution lors de la préparation de la solution mère.
2. Remplissez un plateau de dissection avec suffisamment de solution fixatrice pour immerger tout l’animal.
3. Euthanasier et monter le poisson-zèbre sélectionné dans une solution de fixation.
   note: Le poisson sélectionné peut être un échantillon de rein de poisson-zèbre non traité ou un rein isolé d’un poisson zèbre qui a déjà reçu une injection intrapéritonéale de dextran.
4. Fixez l’échantillon O/N (12 à 16 h) à 4 ^°C.
5. Le lendemain, à l’aide d’une pince fine, détachez soigneusement le rein de la paroi dorsale du corps et placez l’organe dans un flacon en verre à l’aide d’une pipette de transfert.
   REMARQUE : Alternativement, une boîte de culture à 12 puits ou à 24 puits peut être utilisée. Bien qu’un tube de microcentrifugation en plastique puisse être utilisé, les tubes de taille standard (1,5 ml) pourraient limiter le lavage.
6. Lavez le rein disséqué 3 fois avec 3 à 5 ml de 1X PBS avec 0,05 % de Tween pendant 5 min chacun.
7. Retirer le 1X PBS avec 0,05 % de Tween et rincer le rein avec 3 ml d’une solution de saccharose à 5 % (dans 1X PBS) pendant 30 min.
8. Remplacer par 3 ml de solution de saccharose à 30 % (dans 1X PBS) et stocker O/N (12 à 16 h) à 4 ^oC.
   REMARQUE : Les solutions de saccharose perméabilisent les membranes cellulaires, permettant par la suite un marquage spécifique des réactifs lorsqu’ils pénètrent dans les tissus.
9. Le lendemain, retirer la solution de saccharose à 30 % et laver le rein 2 fois avec 5 ml de 1X PBS avec 0,05 % de Tween pendant 5 minutes chacune.
10. Remplacez le 1X PBS par 0,05 % de Tween avec 3 à 5 ml de solution de blanchiment pour éliminer la pigmentation mélanocytaire présente sur l’organe rénal.
11. Placez le flacon en verre sur un rotateur et observez attentivement la disparition de la pigmentation.
    REMARQUE : La dépigmentation prend généralement environ 20 minutes lorsqu’elle est effectuée après un traitement au saccharose, mais peut parfois prendre jusqu’à 60 minutes. Si la solution de blanchiment est laissée trop longtemps sur le rein, la désintégration de l’organe peut se produire ; Il est conseillé de surveiller l’échantillon toutes les 10 à 15 minutes pour vérifier l’intégrité des tissus.
12. Lorsque la pigmentation a été éliminée du rein, laver deux fois avec 3 à 5 ml de 1X PBS avec 0,05 % de Tween.
13. Remplacez le 1X PBS par 0,05 % de Tween avec 3 à 5 ml de solution de PFA à 4 % pendant 1 heure à RT.
14. Retirer la solution de PFA à 4 % et laver le rein 3 fois avec 3 à 5 ml de 1X PBS avec 0,05 % de Tween pendant 5 min chacune.
    REMARQUE : Une fois la fixation terminée, le rein peut également être monté sur une lame de verre et évalué pour l’absorption de dextran sans la pigmentation des mélanocytes.
15. Retirer le 1X PBS avec 0,05 % de Tween et le remplacer par 3 à 5 ml de solution de blocage, puis incuber le rein à RT dans le bloc pendant 2 heures.
16. Une fois le blocage terminé, passez directement au protocole de coloration sélectionné.
    REMARQUE : Le rein peut maintenant être traité par une ou plusieurs autres procédures afin de mener des études de marquage avec différents réactifs.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 fois le PBS			Fabriqué en diluant 10X PBS dans de l’eau distillée
1X PBST			0,1 % de détergent Tween-20 dans 1X PBS
1X PBS avec 0,05 % d’entreformation			0,05 % de détergent Tween-20 dans 1X PBS
Préadolescent 20	Bioanalytique américaine	AB02038
4 % PFA/1X PBS			Dissoudre 4 % de PFA (p/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat #19210) dans 1X PBS, porter à ébullition sur une plaque chauffante dans une hotte. Refroidir et congeler les aliquotes pour les conserver au congélateur à -20°C. Décongeler juste avant utilisation et ne pas recongeler les stocks
Solution de blanchiment			Formule du mélange d’eau de Javel (pour une solution de 20 ml) : 1,6 ml de solution d’hydroxyde de potassium à 10 % 0,6 ml de solution de peroxyde d’hydrogène à 30 % 100 μl de Tween à 20 % Remplir à 20 ml avec de l’eau distillée
Hydroxyde de potassium	sigma	221473
Peroxyde d’hydrogène	sigma	N° H1009
Solution de blocage			Solution bloquante (pour une solution de 10 ml) : 8 ml de 1X PBS avec 0,05 % de Tween 2 ml de sérum de veau fœtal 150 μl de DMSO