Pathologie d’expansion : une méthode d’imagerie optique à haute résolution d’échantillons de tissus cliniques

Résumé

Source : Klimas, A. et al. Imagerie nanoscopique de coupes de tissus humains par expansion physique et isotrope.J. Vis. Exp.(2019)

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode appelée pathologie d’expansion, une variante de la microscopie à expansion, dans laquelle les échantillons de tissus cliniques sont expansés chimiquement à l’aide d’un réseau de polymères pour l’examen microscopique des structures à l’échelle nanométrique.

Protocole

1. Polymérisation in situ des échantillons

1. Incuber l’éprouvette dans une solution d’ancrage.
   1. Préparez la solution d’ancrage (généralement 250 μL suffisent pour couvrir la section du tissu) en diluant la solution mère d’AcX dans 1x PBS à une concentration de 0,03 mg/mL pour les échantillons fixés avec des fixateurs sans aldéhyde ou de 0,1 mg/mL pour les échantillons fixés avec des fixateurs d’aldéhyde, qui ont moins d’amines libres disponibles pour réagir avec AcX.
   2. Placez la lame dans une boîte de Pétri de 100 mm et pipetez la solution d’ancrage sur le tissu. Incuber pendant au moins 3 h à RT ou toute la nuit à 4 °C.
2. Incuber les échantillons dans une solution gélifiante.
   1. Préparez au moins 100 fois le volume excédentaire de solution gélifiante. Par 200 μL, combiner les éléments suivants, dans l’ordre : 188 μL de solution monomère, 4 μL de solution mère 4HT à 0,5 % (dilution 1:50, concentration finale : 0,01 %), 4 μL de solution mère TEMED à 10 % (dilution 1:50, concentration finale 0,2 %) et 4 μL de solution mère APS à 10 % (dilution 1:50, concentration finale 0,2 %).
      REMARQUE : La solution gélifiante doit être préparée immédiatement avant l’utilisation. La solution doit être maintenue à 4 °C et la solution APS doit être ajoutée en dernier, pour éviter une gélification prématurée.
   2. Retirez l’excédent de solution de la section du tissu et placez la lame dans une boîte de Pétri de 100 mm. Ajouter une solution gélifiante fraîche et froide à l’échantillon et incuber le mélange sur le tissu pendant 30 minutes à 4 °C, pour permettre la diffusion de la solution dans le tissu.
3. Construire une chambre sur la lame autour de l’échantillon (figure 1A) sans perturber la solution gélifiante.
   1. Fabriquez des entretoises pour la chambre de gélification en coupant finement des morceaux de verre de couverture à l’aide d’un couteau diamanté.
      REMARQUE : Pour faciliter l’imagerie post-expansion, les espaceurs doivent être proches de l’épaisseur de l’échantillon de tissu afin de réduire la quantité de gel vierge au-dessus du tissu. Le verre numéro 1,5 peut être utilisé pour des échantillons cliniques standard (5−10 μm). Les morceaux de verre de couverture peuvent être empilés pour des échantillons plus épais.
   2. Fixez les entretoises de chaque côté du tissu à l’aide de gouttelettes d’eau (~10 μL).
   3. Placez soigneusement un couvercle en verre de protection sur la lame, en veillant à ne pas emprisonner des bulles d’air sur le tissu (Figure 1B).
4. Incuber l’échantillon à 37 °C dans un environnement humidifié (par exemple, une boîte de Pétri fermée avec une lingette humide) pendant 2 h
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. La chambre à lames peut être stockée à l’intérieur d’une boîte de Pétri scellée à 4 °C.

2. Digestion des échantillons

1. Retirez le couvercle de la chambre de gélification en glissant doucement une lame de rasoir sous la lamelle et en soulevant lentement la lamelle de la surface du gel. Coupez le gel vierge autour du tissu pour minimiser le volume. Coupez le gel de manière asymétrique pour suivre l’orientation du gel après homogénéisation, car l’échantillon deviendra transparent.
   1. Diluer ProK à 1:200 dans un tampon de digestion (concentration finale 4 U/mL) avant utilisation. Préparez suffisamment de solution pour immerger complètement le gel ; un seul puits d’une plaque de culture cellulaire en plastique à quatre puits nécessite au moins 3 mL par puits.
   2. Incuber l’échantillon dans un récipient fermé contenant le tampon de digestion pendant 3 h à 60 °C. Si l’échantillon ne se détache pas de la lame pendant la digestion, retirez délicatement l’échantillon à l’aide d’une lame de rasoir.
      REMARQUE : L’échantillon doit être complètement immergé dans un tampon de digestion pour éviter que l’échantillon ne se dessèche et placé dans un récipient couvert (petite boîte à lames, puits en plastique, boîte de Pétri, etc.) qui peut être scellé avec un film.

3. Expansion de l’échantillon et imagerie

1. À l’aide d’un pinceau doux, transférez l’échantillon dans 1x PBS dans un récipient compatible avec le système d’imagerie souhaité et suffisamment grand pour accueillir le gel entièrement expansé. Assurez-vous que le tissu est placé avec l’échantillon vers le bas si l’imagerie est sur un système inversé ou vers le haut si l’imagerie est sur un système vertical afin de minimiser la distance entre l’objectif d’imagerie et l’échantillon. Retournez le gel à l’aide d’un pinceau doux si nécessaire.
   note: L’éclairage latéral d’une LED peut être utilisé pour les rendre visibles dans un liquide. Une plaque standard à 6 puits peut accueillir des échantillons dont le diamètre pré-expansé est inférieur à 0,6 cm. Une plaque à puits à fond de verre doit être utilisée pour l’imagerie sur un système inversé.
2. Lavez les échantillons dans 1x PBS à RT pendant 10 min. Si vous le souhaitez, colorez à nouveau l’échantillon avec du DAPI 300 nM pendant que le processus de digestion élimine la coloration DAPI. Enlevez le PBS et la tache avec du DAPI 300 nM dilué dans 1x PBS pendant 20 min à RT, suivi d’un lavage de 10 min avec 1x PBS à RT.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être recouverts de 1x PBS et stockés à 4 °C avant de passer à l’étape suivante.
3. Pour élargir les échantillons, remplacez le PBS et lavez avec un volume excédentaire de ddH₂O (au moins 10 fois le volume final du gel) 3 à 5 fois pendant 10 min chacune, à RT.
   note: Après le 3^e ou 4^e lavage, l'expansion de l'échantillon devrait commencer à plafonner. Pour le stockage, afin d’empêcher la croissance bactérienne, le ddH₂O peut être complété par 0,002 % à 0,01 % d’azoture de sodium (NaN₃). Dans ce cas, le facteur de dilatation final est réduit de manière réversible de 10 %.
4. Effectuez une imagerie de fluorescence à l’aide d’un microscope à grand champ conventionnel, d’un microscope confocal ou d’un autre système d’imagerie de votre choix.
   note: Pour éviter que les gels ne dérivent, l’excès de liquide peut être retiré du puits. Les gels peuvent également être immobilisés avec 1,5 à 2 % d’agarose à bas point de fusion. Préparez de l’agarose à bas point de fusion de 1,5 à 2 % (p/v) dans de l’eau dans un récipient de 2 à 4 fois le volume de la solution. Réchauffez la solution dans un bain-marie à 40 °C ou au micro-ondes pendant 10 à 20 s pour faire fondre la solution. Pipetez l’agarose fondue sur les bords du gel. Après avoir laissé l’agarose durcir à RT ou 4 °C, ajoutez de l’eau à l’échantillon pour éviter la déshydratation.

Résultats

Figure 1 : Chambre de gélification des échantillons de pathologie. (A) Deux entretoises, telles que deux morceaux de verre de couverture #1.5 coupés avec un couteau diamanté, sont placées de chaque côté du tissu après l’incubation de l’échantillon dans une solution gélifiante à 4 °C. Les espaceurs doivent être plus épais que les tranches de tissu, afin d’évite...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque inférieure en verre à 6 puits (verre de protection #1.5)	Cellvis	P06-1.5H-N
acétone	Fischer Scientifc	Réf. A18-500
acrylamide	Sigma Aldrich	A8887
Acryloyl-X SE, (AcX)	Invitrogen	N° A20770
Agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Persulfate d’ammonium (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiateur
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	Référence 62248	Coloration nucléaire
Couteau diamant n° 88 CM	Outils généraux	Référence 31116
éthanol	Pharmco	111000200
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M	VWR	BDH7830-1
Échantillon de rein FFPE	USBiomax	HuFPT072
forceps
Micro couvercle en verre #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	Référence 48393 106
Micro couvercle en verre #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	Référence 48393 251
N,N,N′,N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	Réf. T9281	accélérateur
N,N′-méthylènebisacrylamide	Sigma Aldrich	Référence M7279
Boîte de culture cellulaire à 6 puits Nunclon	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL Conique	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Conique	Thermo Fisher	339653
Agitateur orbital
Pinceau
Ph-mètre
saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x	Fischer Scientifc	BP399-1
Boîte de Pétri en plastique (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Protéinase K (grade en biologie moléculaire)	Thermo Scientific	EO0491
lame	Fischer Scientifc	Référence 12640
Safelock Microcentrifugeuse Tubes 1,5 mL	Thermo Fisher	Référence 3457
Safelock Microcentrifugeuse Tubes 2,0 mL	Thermo Fisher	Référence 3459
Acrylate de sodium	Sigma Aldrich	Référence 408220
chlorure de sodium	Sigma Aldrich	S6191
Citrate de sodium tribasique dihydraté	Sigma Aldrich	Réf. C8532-1KG
Base Tris	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	Réf. T8787
xylène	Sigma Aldrich	214736