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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Accès latéral d’une pipette au rein sous une colonne d’imagerie liquidienne via une nouvelle procédure chirurgicale
REMARQUE : L’assemblage du système de support d’imagerie et de la préparation chirurgicale est illustré à la figure 1. La procédure décrite est réalisée sur des souris C57BL/6 pesant de 20 à 25 g.
- Pesez la souris.
- Induire l’anesthésie à l’aide de 4 % d’isoflurane et maintenir avec 1,5 à 2,5 % d’isoflurane dans un mélange air/oxygène. Confirmer que la souris est anesthésiée par l’absence de réponse à un stimulus douloureux et une fréquence respiratoire réduite.
- Lubrifiez les yeux et positionnez l’animal latéralement sur une plaque de base. Immobilisez 4 extrémités à l’aide de ruban adhésif.
- Injecter une solution saline normale, 200 μL, par voie sous-cutanée et placer une sonde de température rectale. Contrôlez la température à l’aide d’une lampe chauffante pendant la chirurgie et d’un coussin chauffant pendant l’imagerie.
- Retirez tous les poils du côté gauche de la souris à l’aide d’une crème dépilatoire.
- Localisez la rate, qui est visible sous la peau, et localisez le rein gauche sur les côtés dorsal et caudal de la rate.
- Faites une incision de 0,5 cm sur la peau et une incision plus petite sur le péritoine, juste assez pour que le rein puisse pousser facilement.
- Extrudez le rein avec une légère pression. Placez une forme stabilisatrice rénale en polysiloxane autour du rein et fixez-la avec un adhésif cyanoacrylate. Alignez le rein avec l’espaceur de sorte que la surface la plus latérale du rein s’étende au-delà du stabilisateur d’environ 1 mm.
- Fixez une plaque de tête à la forme du stabilisateur avec de la colle et montez la plaque de tête sur des barres de montage sur la plaque de base.
- Remplissez le puits dans le support en polysiloxane entourant le rein avec une solution d’agarose à 1 % et placez la lamelle de 10 mm sur le dessus et maintenez jusqu’à ce que l’agarose soit ferme. Scellez la lamelle sur la plaque de tête avec de la colle et créez un anneau autour de la lamelle avec du ciment dentaire.
- Injectez du FITC-dextran (2 000 000 Da, solution à 5 %, 100 à 150 μL) par voie rétro-orbitale et déplacez rapidement la souris et la plaque de fixation vers la platine du microscope à 2 photons, en maintenant l’anesthésie et en assurant un piégeage adéquat des gaz résiduaires sur la platine du microscope.
2. Sélection d'un glomérule approprié et accès à la pipette à l'espace de Bowman
- Définitions:
- Définissez X comme gauche-droite sur l’écran et gauche-droite face au microscope
- Lire SX (stage X) à partir du contrôleur de stage
- Définir PX comme pipette X, sur le contrôleur de cadran de pipette
- Définissez Y comme étant de haut en bas sur l’écran et vers l’avant vers le microscope et vers l’arrière vers la configuration à 2 photons
- Définissez Z comme étant vers le haut, vers le sol, et mesuré sur la scène avec la position Z de l’objectif.
- Définissez S(O)Z comme la hauteur de la scène (en réalité l’objectif).
- Trouvez la surface du rein, identifiable à l’aide des paramètres de filtre de protéine fluorescente verte (GFP) dans l’oculaire. En raison de l’injection de FITC-Dextran, le système vasculaire sera vert vif.
- Identifiez un glomérule approprié. Après avoir identifié la surface du rein à l’aide de l’oculaire, passez en mode 2 photons (mode sans balayage) et explorez la fenêtre d’imagerie. Les caractéristiques favorables à la microponction sont les suivantes : distance verticale sous la lamelle >30 μm (pour éviter la collision entre la pipette et la lamelle lors de l’accès) et distance latérale entre la capsule rénale latérale et le glomérule <400 μm (au-delà de cette distance, la déviation de la pipette peut augmenter la probabilité d’un raté).
- Enregistrez la distance latérale et verticale jusqu’au point de ponction, un point sur la capsule rénale directement du côté pipette du glomérule.
- Élevez le point focal de l’objectif dans la colonne d’eau, en gardant les coordonnées de la scène x et y inchangées, juste environ un centimètre.
- Enfoncez la pointe de la pipette dans la colonne d'eau et activez l'excitation 4',6-diamidino-2-phénylindol (DAPI). Déplacez la pipette dans les dimensions x et y jusqu’au point de fluorescence maximale de la pointe, ce sera le centre de l’objectif. Il est difficile de trouver la pipette dans l’oculaire sans ce prépositionnement précis. Étant donné que les points quantiques sont fluorescents à la même longueur d’onde (dans ce cas, rouge) quelle que soit la longueur d’onde d’excitation, l’excitation DAPI produit une fluorescence rouge, qui est étroitement focalisée sur la pointe, illustrée à la figure 2.
- Réglez le réglage de l’excitation sur la protéine fluorescente rouge (RFP) et visualisez la pipette dans l’oculaire, puis centrez-la précisément dans la vue oculaire.
- Passez à 2 photons et trouvez la pipette sous 2 photons, en la plaçant précisément au centre de l’image. Il s’agit du poste d’inscription.
- Enregistrez une image de la pipette.
- Enregistrez les coordonnées de la platine et du contrôleur de micropipette.
note: Utilisez le fichier .html supplémentaire, qui exécutera les calculs à l’aide de code JavaScript (avantageux sur les systèmes qui n’ont pas de tableur installé) ou une feuille de calcul pour calculer le décalage entre les coordonnées de la platine et de la pipette et pour calculer les coordonnées cibles du contrôleur de pipette.
- Retirez la pipette de la colonne d’eau dans l’axe des x, en gardant z et y identiques.
- Déplacez la pipette Z vers le glomérule cible Z (c’est-à-dire déplacez la pipette vers le bas dans la direction Z sous la lamelle)
- Déplacez la pipette Y jusqu’à la coordonnée Y du glomérule cible.
- Déplacez la vue en direct à 2 photons vers le glomérule cible Z, puis vers le bord du rein et notez le SX.
- Calculez le bord du rein PX en utilisant le décalage par rapport au recalage SX.
- Déplacez la platine vers la pipette (augmentez la SX) de sorte que le bord du rein soit loin à gauche de l’écran, mais toujours visible.
- Avancez rapidement la pipette jusqu’à environ 100 μm de moins que le PX du bord du rein calculé ci-dessus.
- Localisez l’embout de la pipette en avançant lentement la pipette. Augmentez le gain rouge et observez l’histogramme des pixels rouges (la distribution des pixels se décale avant que la pipette ne soit imagée dans la fenêtre, en raison de la luminosité extrême des points quantiques et de la fluorescence hors cible).
- Avancez jusqu’au bord du rein sous l’imagerie à 2 photons en direct.
note: Avant d’entrer dans la capsule rénale, il est possible de rediriger la pipette dans les dimensions Y et Z. Cependant, cela peut casser la pointe de la pipette. Une mesure plus conservatrice, si la pipette n’est pas ciblée, consiste à se retirer dans la dimension X jusqu’à 2 cm, à la rediriger, puis à revenir dans la dimension X vers le bord du rein. Une fois que la pipette est à l’intérieur du tissu, le mouvement dans n’importe quel axe autre que X conduit à une flexion de la pipette qui nécessite une grande expérience pour être utilisée et conduit souvent à la rupture.
- Conduisez lentement la pipette dans l’axe X jusqu’à la cible lumineuse PX, en gardant un œil sur la SX. (Il est utile de revenir de temps en temps au glomérule pour voir s’il s’est déplacé lors de l’insertion de la micropipette).
- Lorsque vous êtes au bon endroit, documentez la position avec un z-stack.
note: Une fois la micropipette en place, des médicaments, des protéines ou des traceurs fluorescents peuvent être injectés, le liquide peut être aspiré pour une analyse ultérieure, ou la pression ou la charge par rapport à une autre électrode peut être mesurée.
3. Aspiration du fluide de l'espace de Bowman
- Réglez la micropompe pour injecter 100 nL de perfluorodécaline pendant 2 minutes afin d’assurer la perméabilité de la pipette et de réduire les facteurs de confusion dus au bouchage de la pipette lors de l’entrée. Recréez l’image pour vous assurer de la position de la pipette.
- Attendez 4 à 6 minutes pour une filtration supplémentaire.
- Réglez la micropompe pour aspirer jusqu’à 300 nL à un débit allant jusqu’à 50 nL/min.
note: Aucun changement dans la morphologie glomérulaire n’est observé avec ce taux, ce qui suggère qu’il ne modifie pas le taux d’administration du liquide dans l’espace pendant l’aspiration. Comme il n’y a pas de bloc d’huile comme dans la micropuncture conventionnelle, la récupération de ce volume, nécessaire à la spectrométrie de masse, pourrait inclure une partie de la perfluorodécaline injectée et éventuellement du liquide tubulaire. Pour des tests tels que les mesures d’électrodes sensibles aux ions, la spectroscopie de fluorescence, la réaction en chaîne par polymérase et d’autres paramètres sensibles, des volumes plus faibles peuvent être utilisés. Si la spectrométrie de masse n’est pas le point final, l’huile minérale et les techniques de micropuncture standard peuvent être utilisées pour mesurer le volume aspiré avant le stockage.
- Image une fois de plus.
- Retirer la pipette et conserver l’échantillon, en ajoutant un tampon TRIS et en le stockant à -80° avant l’analyse.
- Euthanasier la souris à l’aide d’une surdose d’isoflurane ou d’une autre méthode approuvée.
note: Le filtrat pénètre dans l’espace par filtration à partir des capillaires glomérulaires. Le débit de filtration glomérulaire d'un seul néphron (SNGFR) chez la souris est rapporté entre 8 et 14 nL/min. Cependant, les forces de l'étourneau régissent le SNGFR, et la pression hydrostatique négative dans l'espace de Bowman peut donc augmenter le SNGFR. Les méthodes de microponction standard utilisent un blocage tubulaire avec de l’huile et une pression neutre pour l’échantillonnage de fluides tubulaires, mais ces composés interfèrent avec la spectrométrie de masse (voir ci-dessous) ; Par conséquent, dans cette technique, le tubule proximal précoce reste perméable. De plus, au moment de l'aspiration, l'espace de Bowman contient un volume inconnu, mais positif de filtrat. Par conséquent, le taux d’aspiration des fluides peut dépasser SNGFR.
note: Dans les expériences décrites ici, l’objectif était d’obtenir un échantillon plus grand que d’habitude de filtrat glomérulaire pour l’analyse par spectrométrie de masse par des techniques nanoprotéomiques. Étant donné que l’utilisation de la spectrométrie de masse empêche l’utilisation de blocs d’huile avec de l’huile minérale ou de la cire (mélanges complexes de molécules organiques qui réduisent le signal : bruit en spectrométrie de masse), la perfluorodécaline est utilisée pour remplir la micropipette et la seringue. La perfluorodécaline n’est pas connue pour bloquer l’écoulement tubulaire, mais elle est biologiquement inerte et n’interfère pas avec la spectrométrie de masse.
