Culture organotypique rénale sur Chicken CAM : une technique de transplantation d’explants de reins murins sur Chicken CAM pour induire la formation de l’architecture vasculaire rénale

Résumé

Source : Kaisto, S. et al. Optimisation de la culture organoïde et organotypique rénale pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie microscopique améliorée. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit une méthode d’étude du développement d’organes à l’aide d’un dispositif amélioré de xénotransplantation sur membrane chorioallantoïdienne (CAM) à partir d’embryons aviaires. Cette méthode permet le développement d’organes embryonnaires et d’organoïdes entièrement vascularisés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE

1. Fabrication de miniréservoirs pour la culture de reins embryonnaires de souris et d’organoïdes rénaux sur des MCA de poulet et mise en place d’expériences de xénotransplantation

1. Utilisez des inserts de culture cellulaire transwell conçus pour les plaques à 6 ou 12 puits.
   note: Selon l’expérience particulière, des mini-réservoirs de grande ou de petite taille peuvent être utilisés. Il est préférable d’utiliser de petits mini-réservoirs pour la xénogreffe d’un maximum de huit reins embryonnaires ou lorsque plusieurs mini-réservoirs seront placés sur le même embryon de poulet (p. ex., échantillons d’expérience et de contrôle sur le même CAM de poulet).
2. Coupez les côtés des inserts à l’aide d’un outil multifonction rotatif avec une lame de scie circulaire ou d’une scie à main pour créer un anneau en plastique de 2 mm de haut auquel est attachée une membrane perméable.
3. Polissez les bords de ces mini-réservoirs avec un scalpel ou un couteau bien aiguisé.
4. Stérilisez les mini-réservoirs avec de l’éthanol à 70 % pendant au moins 1 h.
5. Lavez les mini-réservoirs dans de l’eau double distillée autoclavée et laissez-les sécher dans une hotte laminaire.
6. Rincer les mini-réservoirs dans du PBS et un milieu de culture (DMEM à haute teneur en glucose/10 % FBS/1 % pénicilline-streptomycine).
7. Placez le réservoir dans une boîte de Pétri, sur une goutte (600 μL/400 μL) de milieu de culture, la membrane vers le haut.
8. Disposez uniformément des reins embryonnaires ex vivo ou des organoïdes rénaux disséqués uniformément sur la membrane à l’aide d’une pipette ou d’un tube capillaire en verre. Évitez de laisser beaucoup de liquide autour des reins.
9. Laissez les échantillons se fixer à la membrane pendant 2 à 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂,
   note: Jusqu’à huit reins embryonnaires de souris E11.5 ou organoïdes rénaux peuvent être disposés sur le petit insert. Le grand insert est recommandé si de plus gros morceaux de tissu embryonnaire seront utilisés pour la xénogreffe ou un mélange cellule-hydrogel sur une plus grande surface de la CAM.
10. Sortir de l’incubateur des poulets embryonnaires de 8 jours cultivés ex ovo préparés selon des méthodes précédemment publiées
11. Transférez les mini-réservoirs dans le CAM de sorte que les greffons soient face au CAM et que la membrane les recouvre. Placez les mini-réservoirs à la périphérie du CAM de manière à ce qu’ils ne recouvrent pas l’embryon de poulet.
    note: Lors de l’utilisation de mini-réservoirs plus petits fabriqués à partir d’inserts de transpuits pour des plaques de 12 puits, jusqu’à trois mini-réservoirs peuvent être placés sur un CAM.
12. Ajouter 500 μL (insert à 6 puits) ou 300 μL (insert à 12 puits) de milieu de culture dans les miniréservoirs.
13. Cultivez les échantillons sur du poulet CAM pendant un maximum de 9 jours. Remplacez quotidiennement le milieu de culture dans les miniréservoirs.
    note: La vascularisation des échantillons peut être observée dès 24 à 48 h après la transplantation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur cellulaire	Panasonic	13090543	Température réglée à 37° C, 90 % d’humidité, 5 % de CO₂
Incubateur cellulaire	SANYO	10070347	Incubateur de culture de poulet CAM. Température réglée à 37° C, 90 % d’humidité, 5 % de CO₂
Medium de l'aigle modifié de Dulbecco	sigma	D777	Glycémie élevée
Éthanol (70 %)	VWR
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Pince DUMONT #5	Dumont	#5SF
Pbs-/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Lavage des mini-réservoirs.
Pénicilline et streptomycine	sigma	Réf. P4333
Inserts de culture cellulaire Thincert à 12 puits avec membrane en polystyrène à pores de 0,4 μm	Greiner Bio-One	665641
Inserts de culture cellulaire Thincert à 6 puits avec membrane en polystyrène à pores de 0,4 μm	Greiner Bio-One	Référence 657610