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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparer les unités stéréotaxiques pour la chirurgie
- Allumez tous les appareils d’anesthésie, les balances de Vernier numériques et les injecteurs numériques.
note: Tous les outils chirurgicaux doivent être nettoyés et stérilisés de manière adéquate avant la chirurgie.
- Utilisez des appareils d’anesthésie avec une chambre d’induction dans une enceinte de sécurité biologique (Figure 1A).
- Assurez-vous que tous les tubes des appareils d’anesthésie sont connectés aux cadres stéréotaxiques (figure 1B, encart 1C) et que les pinces des tubes sont ouvertes pour toutes les unités utilisées. Fermez toutes les pinces sur les tubes allant aux cadres stéréotaxiques qui ne seront pas utilisés pour la chirurgie.
- Réglez les appareils d’anesthésie selon le débit du cône nasal recommandé par le fabricant en fonction du poids de la souris (p. ex., 25 g de poids d’animal : débit du cône nasal de 34 mL/min).
note: Le support de tête inclus dans cette configuration stéréotaxique n’est recommandé que pour les souris adultes. Assurez-vous que les recommandations du fabricant incluses dans la configuration stéréotaxique sont suivies.
- Assurez-vous que l’anesthésique approprié (p. ex., isoflurane) prérempli dans la seringue est fixé à l’appareil d’anesthésie (Figure 1B).
note: Un amorçage excessif de la seringue peut entraîner une administration excessive d’anesthésie aux souris pendant la chirurgie et entraîner une surdose d’anesthésique.
- Préparez les forets en tournant le verrou de la platine, en insérant un adaptateur de foret et un foret de 1 mm dans chaque foret et verrouillez la perceuse en serrant manuellement le verrou de l’embout.
- Fixez les exercices sur les cadres stéréotaxiques (Figure 1C).
2. Placer des souris sur des cadres stéréotaxiques
- Anesthésier les souris (p. ex., isoflurane) à l’aide de la chambre d’induction susmentionnée.
- Maintenez les souris tout au long de la procédure à un plan d’anesthésie profonde. Le % d’anesthésie administré par l’appareil dépend d’un certain nombre de facteurs, notamment : le débit, le degré de stimulation et la température corporelle. Surveiller fréquemment les souris tout au long de la procédure pour détecter la profondeur de l’anesthésie en évaluant les respirations rythmiques (l’animal ne halète pas) ; absence de réflexe palpébral (battement des paupières lorsqu’il est stimulé avec un applicateur à embout de coton) ; et l’absence de pincement de l’orteil (retrait d’un membre sous l’impulsion nocive du pincement des orteils).
note: Différentes souches de souris auront une réponse différente à l’anesthésie.
- Une fois que les souris sont à un plan d’anesthésie profonde approprié, transférez-les dans l’unité stéréotaxique. Utilisez un coussin chauffant pendant que la souris est sur l’appareil stéréotaxique pour maintenir la température corporelle et un plan d’anesthésie approprié.
note: Pour obtenir un profil bas, nous utilisons des chauffe-mains activés par l’air placés dans une boîte à pointe de pipette inversée (boîte élévatrice de souris sur la figure 1D).
- Ouvrez la bouche de la souris et placez les dents dans l'auge de la barre buccale située sur l'embout nasal du cadre stéréotaxique (Figure 2A). Faites glisser le cône nasal sur le nez ou la bouche de la souris (Figure 2B).
- Placez les souris avec leur tête au niveau de la barre buccale. Ouvrez doucement la bouche avec l’extrémité émoussée d’un applicateur à embout de coton et glissez-le en place. Assurez-vous que le cône nasal est complètement sur le nez de la souris, sinon l'anesthésie ne sera pas administrée correctement. Le cône nasal ne s’engagera pas avec le nez si les dents ne sont pas insérées dans cette rainure (Figure 2A).
- À l'aide d'un coton-tige stérile, placez du lubrifiant pour les yeux sur chacun des yeux de la souris. L’application d’un lubrifiant pour les yeux atténue l’assèchement de la cornée et réduit le risque de lésions cornéennes et de complications postopératoires liées aux traumatismes cornéens.
- Stabilisez le crâne de la souris en appuyant la barre de l'oreille gauche contre le canthus médial de l'oreille gauche, en la verrouillant en place à l'aide de la vis sur le cadre stéréotaxique. Ensuite, faites glisser la barre d’oreille droite contre le canthus médial de l’oreille droite et vissez fermement le cadre stéréotaxique (Figure 2B).
note: Assurez-vous que la tête de la souris est de niveau et droite lorsque vous placez des barres d'oreille. Si la tête est tordue ou inclinée, l’injection se fera au mauvais endroit dans le cerveau. Les barres d’oreille doivent être serrées UNIQUEMENT jusqu’à ce que le crâne soit immobilisé lors d’une stimulation avec un sondage manuel modéré.
3. Fabriquer une fenêtre calvaire
- Préparez et nettoyez le cuir chevelu en alternant 3 fois une solution de bétadine et 70 % d’éthanol. En raison de la proximité du site chirurgical avec les yeux, utilisez la solution de bétadine sur le gommage chirurgical.
- À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision de 3 mm à travers la peau le long de la face médiane centrale du crâne (en suivant la ligne de suture sagittale). Le saignement au niveau de l’incision doit être minime. Si cela se produit, appliquez une pression constante et ferme sur le site du saignement avec un applicateur à embout de coton stérile pendant >30 secondes.
- Identifiez et orientez la perceuse perpendiculairement au bregma (Figure 2C), en vous assurant de remettre l’échelle numérique du Vernier à zéro.
- Déplacez la perceuse de 2 mm latéralement par rapport à la suture sagittale et de 1 mm en avant de la suture coronale (Figure 2C). Pour la reproductibilité, assurez-vous que l’emplacement à gauche ou à droite de la ligne de suture sagittale reste cohérent pour tous les animaux.
- Tournez la perceuse à sa vitesse la plus élevée. Assurez-vous que la peau est éloignée de la perceuse pour éviter d’endommager les tissus causés par la mèche rotative et amorcez soigneusement la perceuse sur le crâne. Percez un trou d’environ 0,5 mm de profondeur dans la calvaire, ce qui permet d’obtenir la fenêtre calvaire. Veillez à ne pas abaisser la perceuse trop loin, sinon elle percera le cerveau. Le dépôt d’une solution saline stérile sur le site de forage pendant que la foreuse est en mouvement peut compenser toute chaleur générée par la machine qui pourrait causer des dommages thermiques aux tissus environnants.
- Une fois la fenêtre calvaire réalisée, soulevez délicatement la perceuse et retirez-la du cadre stéréotaxique.
- Nettoyez les forets avec de l’éthanol à 70 % et mettez-les de côté s’ils sont réutilisés. Sinon, retirez les forets et immergez-les dans de l’éthanol à 70 %.
