Dosage de la phagocytose microgliale : un test in vitro pour établir un modèle de phagocytose microgliale pour les cellules de neuroblastome à l’aide de macrophages iPSC

Résumé

Source : Hall-Roberts, H. et al. Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes de neuroblastome par les macrophages iPSC. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous effectuons le test de phagocytose microgliale pour le neuroblastome en utilisant des cellules souches pluripotentes induites. Le test permet d’évaluer l’altération de la fonction microgliale dans les maladies neurodégénératives.

Protocole

1. Marquage des SH-SY5Ys morts avec un colorant fluorescent rouge sensible au pH

1. Commencez avec des cellules SH-SY5Y fixes en suspension dans un milieu tamponné HEPES sans rouge de phénol. Comptez les cellules et prélevez le nombre total de cellules requises dans un tube de 2 ml à faible teneur en protéines. Pour chaque 1 million de SH-SY5Ys, porter le volume total du tube de 2 mL à 300-500 μL avec un média tamponné HEPES sans rouge de phénol. Réchauffez brièvement le tube dans un bain-marie à 37 °C.
2. Reconstituez l’ester STP du colorant fluorescent rouge sensible au pH (voir le tableau des matériaux) et ajoutez 12,5 μg de colorant par million de SH-SY5Y dans le tube chaud de 2 mL de cellules. Mélanger délicatement par pipetage. Incuber le tube à température ambiante pendant 30 min, à l’abri de la lumière.
   note: L’espèce d’ester STP du colorant sensible au pH réagit avec les amines primaires, et par conséquent, le tampon de marquage ne doit pas contenir d’amines libres. En raison de la solubilité potentiellement limitée dans les tampons aqueux, ajoutez le colorant dissous dans le DMSO uniquement pour réchauffer le tampon aqueux, mélangez immédiatement et recherchez des signes de précipité (particules sombres au microscope optique).
3. Ajouter 1 mL de HBSS et centrifuger à 1200 x g pendant 7 min à 4 °C. Jeter le surnageant et laver avec 2 mL de HBSS. Répétez la centrifugation.
4. Jetez le surnageant et mettez à nouveau les cellules en suspension dans un milieu de macrophages sans rouge de phénol (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 200 000 à 1,2 million de cellules/mL, de sorte que 50 μL équivaut à 10 000 à 60 000 cellules (c’est-à-dire 0,5 à 3 fois plus de SH-SY5Ys que de macrophages iPSC).
   note: Le rouge de phénol dans les milieux augmente la fluorescence de fond et, par conséquent, les milieux sans rouge de phénol doivent être utilisés si l’imagerie de cellules vivantes doit être effectuée. Il n’est pas recommandé de stocker le SH-SY5Ys coloré pendant plus de quelques heures car cela n’a pas été évalué. Gardez les SH-SY5Y tachés sur de la glace et protégez-les de la lumière.

2. Coloration des macrophages iPSC

1. Dans une enceinte de sécurité biologique, préparer une solution dans un milieu de macrophages d’un colorant réactif à l’ester succinimidylique fluorescent rouge foncé, perméant aux cellules (voir le tableau des matériaux). Ajouter Hoechst 33342 (voir tableau des matériaux). Réchauffez la solution de travail à 37 °C dans un bain-marie.
2. Aspirez doucement le milieu iPSC-macrophage en pipetant le surnageant cellulaire à l’aide d’une pipette multicanaux dans un réservoir stérile. Ajouter 70 μL/puits de la solution de colorant préparée à l’étape 2.1 dans les macrophages iPSC, à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % CO₂.
3. Préparer des traitements expérimentaux dans des milieux de macrophages sans rouge de phénol. Inclure la cytochalasine D 10 μM comme traitement de contrôle négatif. Après l'incubation, aspirer très doucement le milieu iPSC-macrophage à l'aide d'une pipette multicanaux et ajouter 100 μL/puits de solution saline tamponnée de Hank (HBSS), pour le laver. Éliminer immédiatement le HBSS par pipetage doux, puis ajouter 100 μL de milieux ± de composés. Incuber pendant 10 min à 1 h à 37 °C et 5 % <_{CO 2,br} /> note: La cytochalasine D est un puissant inhibiteur de l’actine et bloque la phagocytose. Pour tous les traitements expérimentaux qui nécessitent une incubation plus longue, par exemple de 24 à 72 h, effectuez le traitement expérimental avant l’étape 2.1, en utilisant 100 μL/puits de traitement dans un milieu de macrophages complet. Suivre les étapes 2.1 à 2.3 conformément au protocole afin que la coloration cellulaire soit effectuée et que le traitement soit ensuite réappliqué dans un milieu de macrophages sans rouge de phénol pour le reste du test de phagocytose.

3. Imagerie de la phagocytose

1. Imagerie à haut contenu à cellules fixes
   1. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 μL du SH-SY5Ys étiqueté par puits, en ajoutant sur le côté de chaque puits au bord du liquide. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 à 5 h.
   2. Après l’incubation de la phagocytose, aspirez doucement les surnageants cellulaires par pipetage à l’aide d’une pipette multicanaux et jetez-les. Laver une fois avec 100 μL de PBS.
   3. Fixer la plaque par addition de 100 μL de paraformaldéhyde à 2 % et incuber pendant 15 min à température ambiante.
   4. Aspirer les puits et ajouter 100 μL de PBS. Couvrir d’une scelleuse de plaque et d’une feuille d’aluminium ; Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      note: La plaque de test peut être stockée ainsi pendant au moins une semaine sans dégradation significative du signal ; Un stockage plus long n’a pas été testé.
   5. Allumez le microscope d’imagerie à haut contenu (voir Tableau des matériaux) et ouvrez le logiciel de capture d’image. Chargez la plaque de test dans le microscope en cliquant sur l’icône Charger en haut de l’écran.
   6. Sélectionnez l’onglet Configuration. Dans les menus déroulants de la boîte en haut à gauche : sélectionnez le type de plaque approprié, sélectionnez l’option de mise au point automatique Deux crêtes (par défaut), sélectionnez l’objectif 40x Eau, NA1.1, sélectionnez le mode Confocal et sélectionnez le binning de 1.
   7. Rincez l’objectif d’eau 40x avant utilisation via le menu Paramètres.
   8. Dans la zone Sélection de chaîne, utilisez l’icône + pour ajouter les chaînes DAPI, Alexa 647 et Alexa 568. Réglez-les pour qu’ils mesurent sur un seul plan de 1 μm. Optimisez les paramètres de temps et de puissance pour l’efficacité de coloration de la plaque de dosage.
      note: À titre indicatif, réglez DAPI à 200 ms d’exposition et 100 % de puissance, Alexa 647 à 1500 ms d’exposition et 100 % de puissance, et Alexa 568 à 100 ms d’exposition et 40 % de puissance.
   9. Assurez-vous que les canaux ne sont pas mesurés simultanément en cliquant sur Séquence de canaux pour séparer les canaux.
   10. Sous Navigation | Définissez la disposition, sélectionnez les puits de mesure et sélectionnez 9 à 12 champs par puits.
   11. Lors de la configuration, cliquez sur un champ représentatif de la carte de la plaque et vérifiez chaque canal de mesure à tour de rôle, pour vous assurer que la coloration est présente et que les images sont nettes, en ajustant le décalage du canal.
   12. Pour que les données soient téléchargées sur un serveur pour une analyse à distance, cliquez sur la case Tâches en ligne et le nom d’écran approprié, ce qui permettra de télécharger automatiquement les données sur un serveur après l’imagerie.
   13. Enregistrez le protocole de test en cliquant sur le bouton Enregistrer.
   14. Cliquez sur l’onglet Exécuter l’expérience en haut et nommez la plaque d’expérience, puis cliquez sur Démarrer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger conique de 15 mL	Faucon	352096	Pour la centrifugation des cellules
Micropipettes monocanal 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
4 % de paraformaldéhyde dans le PBS	Alfa Aesar	J61899	Pour la fixation des cellules
Plaque à 6 puits, traitée pour culture tissulaire
AggreWell-800 Plaque 24 puits	Technologies STEMCELL	Référence 34815	Plaque à 24 puits à faible adhérence pour la formation de corps embryoïdes
Compteur de cellules automatisé
Centrifugeuse de paillasse
Microcentrifugeuse de paillasse
Microplaques CellCarrier-96 Ultra, traitées pour culture tissulaire, noires, 96 puits avec couvercle	Perkin Elmer	6055302	Microplaque traitée par culture tissulaire (CT) à 96 puits avec parois noires et fond optiquement transparent, pour le dosage de la phagocytose
Logiciel CellProfiler			Logiciel open source pour l’analyse d’images de phagocytose obtenues par microscope time-lapse sur cellule vivante. Téléchargez-le gratuitement sur le site (http://cellprofiler.org/), ce protocole utilise la version 2.2.0.
Colorant CellTracker Deep Red	Thermo Fisher	Réf. C34565	Colorant réactif à l’ester succinimidylique, fluorescent rouge foncé, perméant aux cellules, pour la coloration du cytoplasme des macrophages iPS. Dissoudre le colorant CellTracker Deep Red dans du DMSO à 2 mM (1,4 mg/mL). Utilisation à 1 μM, par dilution de la matière DMSO avec un milieu de macrophage.
Enceinte de sécurité à flux d’air laminaire de classe 2
Bouteille de gaz CO2			Accessoire pour EVOS FL Auto
Incubateur à CO2, réglé à 37 °C et 5 % de CO2
Cytochalasine D	caïman	Référence 11330	Traitement témoin négatif pour le dosage de la phagocytose. Reconstituer dans le DMSO à 10 mM et stocker les aliquotes à -20°C, éviter d’autres cycles de gel-dégel. Utilisation à la concentration finale 10 μM.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Composant du support SH-SY5Y
Dmso	sigma	D8418	Solvant pour colorants CellTracker et pHrodo
Sérum fœtal bovin	sigma	F4135	Composant du support SH-SY5Y
Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit sans Geltrex LDEV, qualifiée hESC	Invitrogen	A1413302	Matrice de membrane basale qualifiée hESC pour la culture d’iPSC
Supplément GlutaMAX	Gibco	Référence 35050-038	Composant des milieux d’usine et de macrophage
HBSS	Lonza	BE 10-547F	La solution saline équilibrée de Hank pour les étapes de lavage
IL-3 recombinante humaine	Gibco	PHC0033	Composant des milieux d’usine et de macrophage
Solution d’imagerie de cellules vivantes	Thermo Fisher	A14291DJ	Média tamponné HEPES sans rouge de phénol pour l’étiquetage des SH-SY5Ys morts
Tubes de 2 mL à faible liaison protéique	Eppendorf	Référence 30108.132	Pour la coloration SH-SY5Ys
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	Composant des milieux d’usine et de macrophage
mTeSR1 Moyenne	Technologies STEMCELL	Référence 85850	Médias iPSC
Pipette multicanaux 20-200 uL			Pour la manipulation de liquides sur plaque à 96 puits
Réactif NucBlue Live ReadyProbes	Thermo Fisher	R37605	Formulation Hoechst 33342 dans un flacon compte-gouttes pour la coloration des noyaux des macrophages iPS, utiliser 0,5 gouttes/mL dans un milieu macrophage.
Système de projection à haut contenu Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14000000	Microscope imageur à haut contenu, utilisé avec la version 4.9 du logiciel Harmony.
Pénicilline-streptomycine	Gibco	Référence 15140-122	Composant des milieux Factory, Macrophage et SH-SY5Y
pHrodo iFL Red STP-Ester	Thermo Fisher	Réf. P36011	Colorant fluorescent rouge sensible au pH pour l’étiquetage des SH-SY5Y morts. Reconstituer la poudre d’ester rouge STP pHrodo iFL dans du DMSO à une concentration de 5 mg/mL. Pour chaque 1 million de SH-SY5Ys, ajouter 2,5 μL (12,5 μg) de stock d’esters pHrodo iFL Red STP dans des cellules préchauffées en suspension dans une solution d’imagerie de cellules vivantes.
Remplisseuse de pipette sérologique
Fiole T175, traitée pour culture tissulaire			Récipient pour les différenciations des précurseurs d’iPSC-macrophages, connu sous le nom d'"Usines »
Fiole T75			Récipient pour la culture SH-SY5Y
Soudeuses de plaques transparentes	Greiner Bio-One	676001	Pour le stockage et le transport des plaques d’essai
Bain-marie, réglé à 37°C
X-VIVO 15 Medium avec L-glutamine, gentamicine et rouge de phénol	Lonza	BE04-418F	Composant des milieux d’usine et de macrophage
X-VIVO 15 Medium avec L-glutamine, sans gentamicine ni rouge de phénol	Lonza	04-744Q	Milieu de macrophages sans rouge de phénol, pour une utilisation en phagocytose sans additifs ni facteurs de croissance