Isolement de noyaux à partir de tissus de gliome frais congelés : une méthode pour obtenir des noyaux intacts à partir d’échantillons de tumeurs de gliome

Résumé

Source : Narayanan, A. et al. Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour le séquençage de l’ARN à noyau unique et le séquençage de l’ATAC. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome fraîchement congelés. Les noyaux uniques isolés peuvent être utilisés comme échantillons pour des techniques de séquençage telles que le séquençage de l’ARN à noyaux uniques (snRNA) et le dosage des noyaux uniques pour le séquençage de la chromatine accessible à la transposase (snATAC) afin d’obtenir des informations plus approfondies sur l’hétérogénéité inter- et intra-tumorale observée dans le gliome des tissus nerveux centraux.

Protocole

1. Dissection et dissociation tissulaire

1. Transférez l’échantillon de tissu frais congelé (10 à 60 mg) dans une boîte de Pétri pré-réfrigérée. Hacher des tissus frais congelés avec une lame de rasoir en petits morceaux sur de la glace.
2. Ajouter 500 μL de tampon de lyse des noyaux refroidi dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL. Placez les morceaux de tissu dans le tube de 1,5 mL contenant le tampon de lyse des noyaux et transférez-les dans un annonceur (Table des matériaux).
   note: Il y a deux pilons homogénéisateurs Dounce : le pilon « lâche » ou « A » pour la réduction initiale de l’échantillon et le pilon « serré » ou « B » pour l’homogénéisation complète de l’échantillon.
3. Énoncez les morceaux de tissu avec le pilon « lâche » pendant environ 20 coups, jusqu’à ce que la friction soit réduite. S’il y a des débris, l’échantillon peut être pré-nettoyé par filtration à l’aide d’une crépine de 100 mm.
4. Appliquer avec le pilon « serré » en 20 coups pour obtenir une homogénéisation complète des tissus.
5. Transvaser l’homogénat (environ 500 μL) dans un tube pré-refroidi de 2 mL. Ajouter 1 mL de tampon de lyse réfrigéré. Mélangez délicatement et laissez incuber sur glace pendant 5 min. Mélangez délicatement avec une pointe de pipette à large calibre et répétez l’opération 1 à 2 fois pendant l’incubation.
6. Filtrez l’ensemble de l’homogénat à l’aide d’une crépine de 30 μm, collectez-la dans un tube Falcon de 15 ml et transférez-la à nouveau dans un nouveau tube pré-refroidi de 2 ml. Une seule passoire suffit généralement pour l’ensemble de l’homogénat.
7. Vérifier au microscope optique l’enlèvement des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Les noyaux doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée. Si des débris sont présents, les noyaux peuvent être refiltrés.
8. Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C sur une centrifugeuse de paillasse. Retirer le surnageant en laissant derrière lui ~50 μL avec une pastille contenant les noyaux. Remettez doucement la pastille en suspension dans 1 autre mL de tampon de lyse des noyaux et incubez pendant 5 min sur de la glace.
9. Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant sans perturber la pastille, ajouter 500 mL de 1x tampon d’homogénéisation (HB) (tableau 1) et incuber pendant 5 min sans remettre en suspension. Ensuite, remettre les noyaux en suspension dans 1,0 mL supplémentaire de 1x HB.
10. Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre doucement les noyaux en suspension dans 200 μL de 1x HB dans un nouveau tube de 2,0 mL.

    Tableau 1 : Préparation d’une solution instable de tampon d’homogénéisation 1x (2 mL par échantillon)

    finale

    1x Tampon d’homogénéisation Solution instable (2 mL par échantillon)
    Réactif	Conc.	Vol par échantillon (μL)
    6x tampon d’homogénéisation instable	1x	333,33
    1 M de saccharose	320 millions d’euros	640,00
    50 mM EDTA	0,1 million d’euros	4.00
    10 % NP40	0,1 %	20.00
    H2O		1006.27

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoéthanol	sigma	M6250
CaCl2	sigma	21115-100ML
EDTA (0,5 M)	Thermo Scientific	Réf. R1021
Falcon 15 mL Tubes à centrifuger coniques	Fisher Scientific	352096
Filtres intelligents MACS (100 μm)	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-098-463
Mg(Ac)2	sigma	Référence 63052-100ML
NP-40	Abcam	AB142227
Kit d’isolation des noyaux : Nuclei EZ Prep	sigma	NUC101-1KT
Tubes de verrouillage de sécurité 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Tubes de sécurité 2,0 mL	Eppendorf	30120094
saccharose	sigma	S0389
Pointes de pipette à alésage large (1000 μL)	Themo Fisher Scientific	2079GPK