$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Centrifugation par gradient
- Ajouter 200 μL de solution d’iodixanol à 50 % (tableau 1) pour obtenir une concentration finale d’iodixanol à 25 %. Bien mélanger 10 fois avec une pipette posée sur 300 mL.
- Ajouter 300 μL de solution d’iodixanol à 29 % (tableau 2) sous le mélange à 25 %. Utilisez une pointe fine P1000 pour éviter le mélange des couches.
- Ajouter 300 μl de solution d’iodixanol à 35 % (tableau 3) sous le mélange à 29 %. Utilisez une pointe fine P1000 pour éviter le mélange des couches.
prudence: Cette étape nécessite un retrait progressif de la pointe de la pipette pendant le pipetage afin d’éviter un déplacement de volume excessif.
- Placez les échantillons dans une centrifugeuse à godets oscillants, faites tourner pendant 20 min à 3 500 x g à 4 °C avec le frein desserré.
- Prélever délicatement les échantillons sans les secouer et observer à la lumière. Une bande blanche claire de noyaux purs à 95 % doit être visible entre la deuxième et la troisième couche (Figure 1).
2. Isolement des noyaux
- Aspirez les couches supérieures jusqu’à ce que les noyaux blancs se forment à l’interphase de 29 % à 35 %.
- Prélever la bande des noyaux dans un volume de 200 ml, transférer dans un tube frais et filtrer avec un filtre de 20 μm (Table des matériaux).
note: Les noyaux n’ont pas besoin d’être remis en suspension avant la filtration.
- Vérifier au microscope optique l’enlèvement des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Les noyaux doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée.
- Compter les noyaux à l’aide de la coloration au bleu de trypan sur un hémocytomètre et des noyaux aliquotes pour le snRNA-seq/snATAC-seq.
Tableau 1 : Préparation du Master Mix stable de tampon d’homogénéisation 6x
stable
finale
| 6x Tampon d’homogénéisation Master Mix |
| Réactif | Conc. | Vol pour 100 (mL) |
| 1 M CaCl₂ | 30 millions d’euros | 3,0 |
| 1 M Mg(Ac)₂ | 18 millions d’années | 1.8 |
| 1 M Tris pH 7,8 | 60 millions de mètres | 6,0 |
| H₂O | | 89,2 |
| Conserver à température ambiante, éviter l’exposition directe à la lumière |
Tableau 2 : Préparation de 1 M de saccharose
| 1 M de saccharose |
| 34,23 g de saccharose |
| Dissoudre dans 78,5 mL d’eau |
| Remplissez jusqu’à 100 ml d’eau |
Tableau 3 : Préparation d’une solution instable de tampon d’homogénéisation 6x (650 μL par échantillon)
finale
| 6x Tampon d’homogénéisation Solution instable (650 mL par échantillon) |
| Réactif | Conc. | Vol par échantillon (μL) |
| 6x tampon d’homogénéisation stable | 6 fois | 648,84 |
| 100 mM PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle) | 0,1 million d’euros | 1,08 |
| 14,3 M β-mercaptoéthanol | 1 million d’euros | 0,08 |
