Coupe de tissu cérébral de souris congelée : une procédure pour obtenir de fines sections de tissu congelé à partir de tissu cérébral murin congelé

Résumé

Source : Comba, A. et al. Microdissection par capture laser de sous-régions de gliome pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncoflux et de l’invasion. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous montrons la section d’un tissu tumoral cérébral de souris congelé à l’aide d’un cryostat. Les coupes de tissu cérébral congelé ainsi obtenues sont stockées à basse température jusqu’à une analyse plus approfondie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Sectionnement des tissus tumoraux cérébraux congelés

1. Étiquetez les lames de polyéthylène naphtalate (PEN) de 2 μm avec les informations de l’échantillon. Des coupes de tissus seront placées directement sur ces lames après la section.
2. Réglez la température de la chambre du cryostat entre -20 et -24 °C. Avant de sectionner, placez le bloc d’échantillon dans la chambre du cryostat et laissez-le s’équilibrer en fonction de la température dans la chambre pendant 30 à 60 min.
3. Nettoyez la chambre du cryostat et le porte-couteau avec de l’éthanol à 100 % et vaporisez les pinceaux à utiliser avec la solution de nettoyage RNase. En travaillant à l’intérieur de la chambre du cryostat, retirez le moule et fixez le bloc OCT contenant le cerveau au disque de l’échantillon du cryostat avec OCT. Placez le bloc dans le support de disque et alignez le bloc avec la lame du couteau.
4. Installez une lame jetable dans le support de sectionnement.
5. Sectionnez le cerveau à 10 μm d’épaisseur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de stries ou de lignes de grattage dans le tissu. À l’aide d’un pinceau, aplatissez et déroulez soigneusement le tissu sur la surface de coupe.
6. Montez soigneusement le tissu contenant les sections de cerveau sur des lames de verre PEN sans RNase. Retournez les lames de verre chargées positivement avec les doigts dans la direction du tissu et appuyez doucement sur la lame de verre vers la section du tissu.
   note: La température des mains aidera le tissu à se fixer au verre.
7. Après avoir monté les sections de cerveau sur les lames, conservez les lames dans une boîte à l’intérieur de la chambre du cryostat, puis stockez-les à -80 °C. Ne conservez jamais les lames à température ambiante.
   note: Le pliage du tissu et la déchirure sont fréquents. Pour une analyse postérieure précise, il est important de minimiser ces artefacts.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lame de verre à membrane PEN (2 μm)	Lieca	1150518
Cryostat de recherche	Leica	CM3050s
Solution de décontamination RNaseZap RNase	Fisher Scientific	AM9780
Moules d’enrobage jetables Peel Away	Sciences de la microscopie électronique	Référence 70182
Une solution précise	Recherche Zymo	D3001-1
Composé Tissue-Plus O.C.T.	Fisher Scientific	Tél. : 23-730-571