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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Fixation et coloration de coupes de tissu cérébral cryoconservé
- Pour préserver l’intégrité de l’ARN, nettoyez tous les instruments à utiliser avec la solution de nettoyage RNase. Procédez au protocole de fixation et de coloration à l’intérieur d’une hotte.
- Préparez les solutions fixatrices décrites dans des tubes propres de 50 mL sans RNase. Faites toutes les solutions avec de l’eau sans RNase le jour de la coloration.
- Le même jour, la microdissection au laser sera effectuée, préparez des solutions d’éthanol à 100 %, 95 %, 70 % et 50 %. Conservez les solutions dans des tubes hermétiquement fermés à température ambiante.
- Préparez du violet de crésyle à 4 % et de l’éosine Y à 0,5 % dans une solution d’éthanol à 75 %. Agitez vigoureusement la solution pendant 1 min et filtrez-la à travers un filtre en nylon de 0,45 μm pour éliminer les traces de poudre non dissoute.
- Placez les lames de tissu dans un récipient contenant de l’éthanol à 95 % pendant 30 s. Transférez les lames dans le tube contenant de l’éthanol à 75 % et laissez-y les lames pendant 30 s.
- Transférez les diapositives à 50 % d’éthanol et laissez-les là pendant 25 s. À ce moment-là, le PTOM sera dissous. Transférez la lame dans une solution de violet de crésyle à 4 % pendant 20 s, puis transférez dans une solution d’éosine Y à 0,5 % pendant 5 s.
- Retirez la lame de la solution de colorant et épongez-la avec un papier filtre. Ensuite, placez les lames dans de l’éthanol à 50 % pendant 25 s. Transférez les lames à 75 % d’éthanol pendant 25 s. Transférez les lames à 95 % d’éthanol pendant 30 s. Transférez les lames à 100 % d’éthanol pendant 60 s.
- Rincez la lame avec du xylène. Transférez-les dans un récipient avec du xylène et attendez 3 min.
- Préparez le milieu de montage (par exemple, la gomme Pinpoint) dans de l’eau sans RNase. Pour monter des sections de cerveau de souris, diluez le milieu de montage dans de l’eau exempte de RNase dans un rapport de 1:10.
- Faites sécher les lames sur une surface exempte de RNase à température ambiante pendant 10 s. Avant que le xylène ne sèche, procédez au montage des lames avec les sections de tissu.
- Dispersez délicatement la solution de montage sur le tissu de la lame à l’aide d’un pinceau fin stérile et sans RNase. Attendez 10 à 20 s, puis transférez immédiatement les lames de tissu sur la plateforme de microdissection au microscope.
REMARQUE : Le rapport entre le milieu de montage et l’eau exempte de RNase utilisée pour le montage varie en fonction du tissu d’intérêt. Le rapport milieu de montage/eau préserve la morphologie du tissu du gliome pour la microdissection laser sans affecter l’intégrité de l’ARN.