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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de suspension unicellulaire à partir du cerveau
- Diluer le milieu à gradient de densité dans un rapport de 9:1 avec du PBS dans un tube conique de 15 mL pour obtenir une solution finale à 100 %.
- Anesthésier les souris au pic de l’EAE avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg) et perfuser par voie intracardiale avec 20 mL de PBS stérile glacé. Pour ce faire, injectez lentement et régulièrement du PBS dans le ventricule gauche du cœur à l’aide d’une seringue de 20 ml et ouvrez l’oreillette droite.
- Coupez soigneusement le crâne du nez au cou, puis retirez le cerveau de la boîte crânienne dans 10 ml d’IPRP dans des tubes coniques de 50 ml. Bien mélanger pour éliminer les globules rouges adhérents. Ensuite, retirez le milieu par aspiration et ajoutez 10 ml de RPMI.
- Placez la cervelle et le milieu dans une coupelle de 100 mm. Hacher finement avec une lame de rasoir.
- Transférez 6 ml de la boîte dans un homogénéisateur en verre fritté de 7 ml glacé à l’aide d’une pipette propre. Évitez de laisser de grandes quantités de tissu dans la pipette. Une petite quantité est inévitable.
- Broyez d’abord le cerveau à l’aide du piston « lâche », puis utilisez le piston « serré » jusqu’à ce que la suspension soit homogène et versez dans un tube conique pré-refroidi de 15 ml et conservez sur de la glace.
- Une fois tous les échantillons homogénéisés, estimez le volume. Réglez le volume avec RPMI à 7 ml. Ensuite, placez 3 ml de matrice de membrane basale 100 % glacée dans un tube à centrifuger conique réfrigéré de 15 ml et ajoutez 7 ml d’homogénat de cerveau pour obtenir un milieu final à gradient de densité de 30 %. Mélangez par inversion plusieurs fois. Ne faites pas de vortex.
- Pour assurer une interface nette, ajoutez soigneusement et lentement 1 ml de milieu à gradient de densité de sous-couche à 70 % dans RPMI avec une pipette de 3 ml.
- Centrifugeuse à 800 x g pendant seulement 20 min à 4 °C. Réglez l’accélération sur 1 et la décélération sur 0. Après la centrifugation, aspirez presque toute la phase supérieure, en prenant soin d’éliminer complètement la myéline par le haut (Figure 1).
- Retirez l’interface dans un nouveau tube à centrifuger 15. Réglez le volume à 10 ml avec RPMI.
- Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min. Après la centrifugation, aspirer le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans ~200 μL de tampon de coloration par cytométrie en flux (FSC).
