Extraction basée sur l’immunoaffinité de peptides ubiquitinylés : une technique d’extraction sélective de peptides marqués à l’ubiquitine à partir de fractions peptidiques purifiées

Résumé

Source : Bezstarosti, K. et al. Détection des sites d’ubiquitination des protéines par enrichissement peptidique et spectrométrie de masse. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit une méthode permettant d’extraire et de purifier des peptides ubiquitinylés contenant des peptides de diglycine restants à partir d’un mélange complexe de peptides. La méthode présentée peut aider à identifier les sites d’ubiquitination originaux dans la protéine.

Protocole

1. Extraction de peptides ubiquitinylés

1. Utilisez la chromatographie en C18 à pH inverse (RP) élevé avec un matériau polymère en phase stationnaire (300 Å, 50 μM ; voir le tableau des matériaux) chargé dans une cartouche à colonne vide pour fractionner les peptides tryptiques. La taille du lit de la phase stationnaire doit être ajustée à la quantité de protéines digérées à fractionner. Préparez une cartouche de colonne vide de 6 mL (voir le tableau des matériaux) remplie de 0,5 g de matériau en phase stationnaire pour ~10 mg de digestion des protéines. Le rapport entre la digestion des protéines et la phase stationnaire doit être d’environ 1:50 (p/p).
2. Chargez les peptides sur la colonne préparée et lavez la colonne avec environ 10 volumes de colonne de TFA à 0,1 %, suivis d’environ 10 volumes de colonne de H2O.
3. Éluer les peptides en trois fractions avec 10 volumes de colonne de solution de formiate d’ammonium de 10 mM (pH = 10) avec 7 %, 13,5 % et 50 % d’acétonitrile (AcN), respectivement. Lyophiliser toutes les fractions jusqu’à ce qu’elles soient complètes.
4. Utiliser des anticorps à motif résiduel d’ubiquitine (K-ε-GG) conjugués à des billes d’agarose de protéine A pour l’immunoenrichissement de peptides diGly. Étant donné que la quantité exacte d’anticorps par lot de billes est une information exclusive et n’est pas divulguée par le fabricant, il est recommandé d’utiliser la même définition pour un lot de billes que le fabricant afin d’éviter toute confusion. Lavez un lot de ces billes 2 fois avec du PBS et divisez la boue de perles en six fractions égales. Voir la figure 1 pour un schéma expérimental détaillé.
5. Dissoudre les trois fractions peptidiques recueillies à l’étape 1.3 dans 1,4 mL d’un tampon composé de 50 mM de MOPS, de 10 mM de phosphate de sodium et de 50 mM de NaCl (pH = 7,2), puis faire tourner les débris.
6. Ajouter les surnageants des fractions dans les billes d’anticorps diGly et incuber pendant 2 h à 4 °C sur une unité de rotateur. Faites tourner les billes et transférez le surnageant dans un nouveau lot de billes d’anticorps et incubez à nouveau pendant 2 h à 4 °C.
7. Stockez les surnageants pour une analyse ultérieure du protéome global (GP).
8. Transférez les billes de chaque fraction dans une pointe de pipette de 200 μL équipée d’un bouchon de filtre GF/F pour retenir les billes. Placez la pointe de la pipette avec les billes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL équipé d’un adaptateur de pointe de centrifugeuse. Lavez les billes 3 fois avec 200 μL de tampon IAP glacé, puis 3 fois avec 200 μL de Milli-Q H₂O. Faites tourner la colonne à 200 x g pendant 2 min avant chaque étape de lavage, mais veillez à ne pas laisser la colonne sécher Éluer les peptides à l’aide de 2 cycles de 50 μL de TFA à 0,15 %.
9. Dessalez les peptides à l’aide d’une pointe de platine C18 (essentiellement une pointe de pipette de 200 μL avec deux disques C18) et séchez-les jusqu’à ce qu’ils soient complets à l’aide de la centrifugation sous vide.

Résultats

Figure 1 : Vue d’ensemble de l’expérience.(A) Vue d’ensemble de l’approche expérimentale. Les échantillons ont été préparés, trypsinisés et fractionnés en trois fractions à l’aide de la chromatographie en phase inverse avec élution à pH élevé. Un lot de billes d’anticorps peptidiques α-diGly commerciales a été divisé en six fractions égales et les trois fractions peptidiques ont ensuite été chargées sur trois des fractions de bil...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lysyl endopeptidase(LysC)	Produits chimiques purs Wako	Référence 129-02541
Four NanoLC	Conception MPI, MS Wil GmbH
Sel sodique N-Lauroylsarcosine	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectromètre	ThermoFisher
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polymère particules en phase inverse	Agilent Technologies	Réf. PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitine Remnant Motif (K-ε-GG) Trousse	Technologies de signalisation cellulaire	Référence 5562
Sep-Pak tC18 Cartouche Vac 6 cc	eaux	WAT036790	Retirez le matériau tC18 du cartouche avant de remplir la cartouche avec PLRP-S
Désoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	Référence 30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	Réf. T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	Réf. T5941
Trypsine, traitée TPCK	ThermoFisher	Référence 20233