Test de synthèse d’ADN : une technique pour évaluer la synthèse de l’ADN dans les cellules en prolifération à l’aide de l’incorporation radioactive de thymidine tritiée

Résumé

Source : Williams, M. et al. Détection rapide des phénotypes neurodéveloppementaux dans les cellules précurseurs neurales humaines (NPC). J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous déterminons la capacité de prolifération des cellules progénitrices neuronales en mesurant l’incorporation du traceur radioactif tritié thymidine dans l’ADN des cellules. Cette technique peut être utilisée pour étudier la prolifération cellulaire après un traitement avec certains médicaments et facteurs de croissance.

Protocole

1. Maintenance des PNJ

1. Placez les NPC à une densité de 1,5 million de cellules dans un puits enduit de gel imitant l’ECM contenant 2 ml de milieu d’expansion à 100 %.
2. Incuber les NPC à 37 °C dans un environnement humide avec 5 % de CO₂.
3. Ajouter 5 μM d’inhibiteur de ROCK dans le milieu pour les NPC à P3 ou moins, ou pour les NPC décongelés, afin d’éviter une mort cellulaire excessive. Changez de média après 24 h pour éliminer l’inhibiteur de ROCK.
4. Cellules de passage tous les 4 à 9 jours, selon le moment où elles deviennent confluentes. Les cellules sont considérées comme confluentes lorsqu’elles deviennent une monocouche densément tassée couvrant tout le fond de la surface de la parabole.
5. Plaquez les NPC à une densité de 1 à 1,5 million de cellules par puits d’une plaque à 6 puits. Retirez le support usagé toutes les 48 h et remplacez-le par 2 ml de support d’expansion à 100 %.

3. Essai de synthèse de l’ADN cellulaire des précurseurs neuraux

1. Plaquez 100 000 cellules/puits dans une plaque de 24 puits et évaluez en trois exemplaires/condition.
2. Ajouter de la [^3-H]-thymidine tritiée radioactive au milieu de culture (1,5 μCi/mL) dans chaque puits après 46 h de culture. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 h
   note: Lorsque vous utilisez des matières radioactives, recevez une formation de votre établissement, suivez les protocoles de sécurité en matière de radioactivité et éliminez les matières radioactives dans les récipients à déchets appropriés.
3. Retirer et éliminer correctement les milieux radioactifs après 2 h. Ajouter 300 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % (0,5 mM) préchauffé dans chaque puits et incuber pendant 20 minutes à 37 °C.
4. Allumez le récupérateur de cellules (voir la section Matériaux) et la pompe et assurez-vous que la pression de la pompe est inférieure à 200 PSI. Placez du papier filtre dans l’espace du récupérateur de cellules et déchirez le coin droit pour marquer l’orientation du papier.
5. Placez les tubes collecteurs du récupérateur de cellules dans un plateau vide et appuyez sur le prélavage pour humidifier le papier filtre. Placez les tubes collecteurs dans les puits d’échantillonnage et faites fonctionner (commencer).
6. Lorsque le collecteur de cellules a terminé de collecter des échantillons, soulevez la pince et avancez le papier filtre pour répéter l’opération pour tous les ensembles d’échantillons. Prélavage toujours dans une assiette vide et « vierge ».
7. Faites sécher le papier filtre sous une source lumineuse et placez les flacons correspondants dans un plateau. Découpez des chads de papier dans des flacons et ajoutez 2 ml de cocktail à scintillation liquide dans chaque flacon. Boucher et étiqueter les flacons.
8. Incuber les flacons dans un cocktail à scintillation liquide pendant au moins 1 h avant de lire les comptes par minute (CPM) sur une machine à scintillation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 Moyen avancé	ThermoFischer Scientific	Référence 12634-010	Composant du support d’expansion à 100 %
Milieu neurobasal	ThermoFischer Scientific	21103049
Plaques à 24 puits	ThermoFischer Scientific	2021-05	Plaques de polystyrène : utilisées pour le test de synthèse de l’ADN NPC
Laminine de souris naturelle	Invitrogen	Référence 23017-015	Substrat pour le revêtement des plaques : Utilisé pour la synthèse de l’ADN NPC, l’entrée en phase S et les dosages du nombre de cellules
Pénicilline/streptomycine	ThermoFischer Scientific	15140122	Antibiotique, composant dans les milieux d’expansion
2,5 % de trypsine (10X)	Gibco	Référence 15090-046	Solution enzymatique 10X
0,5 M EDTA	ThermoFischer Scientific	AM9261	Utilisé dans une solution de trypsine pour soulever les cellules pour le test de synthèse de l’ADN
[3H]-thymidine tritiée	PerkinElmer	NET027E001	Tritium radioactif, thymidine
Fisherbrand Flacons à scintillation en PEHD de 7 mL	Fisherbrand	Référence 03-337-1	Flacons pour comptage par scintillation liquide
EcoLite(+)	MP Biomédical	188247501	Cocktail à scintillation liquide
Compteur à scintillation liquide polyvalent LS 6500	Beckman Coulter	Référence 8043-30-1194	Compteur à scintillation liquide
Récolteuse de cellules semi-automatique Skatron	Dispositifs moléculaires et Skatron Instruments, Inc.	Type 11019	Récolteuse de cellules semi-automatique
Papier filtre de qualité GF/C, Whatman	GE Healthcare Sciences de la vie	De 1822 à 849	Papier filtre en fibre de verre