Essai NPC sur la neurosphère : un essai in vitro pour évaluer la réponse migratoire des cellules précurseurs neurales de la neurosphère

Résumé

Source : Williams, M. et al. Détection rapide des phénotypes neurodéveloppementaux dans les cellules précurseurs neurales humaines (NPC).J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente le test de migration de la neurosphère des cellules précurseurs neurales, un test in vitro permettant d’étudier la réponse migratoire des cellules précurseurs neurales de la neurosphère, via une analyse microscopique.

Protocole

1. Essai de migration de la neurosphère NPC

1. Formation de la neurosphère
   1. Ajouter 1 mL de média d’expansion à 100 % dans un plat de 35 mm sans substrat de revêtement. Incuber les boîtes pendant au moins 15 minutes à 37 °C avant de dresser les PNJ. Préparez 2 à 3 boîtes pour vous assurer qu’il y aura suffisamment de neurosphères pour le test de migration cellulaire.
      note: L’absence de substrat de revêtement garantit que les NPC restent en suspension dans le milieu, ce qui est essentiel à la formation de la neurosphère. Le revêtement de la vaisselle empêchera la formation de la neurosphère.
   2. Soulever, dissocier et granuler les cellules. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 2 à 5 ml de milieu d’expansion à 100 % préchauffé. Versez 1 million de PNJ dans chaque plat de 35 mm préparé à la section 1.1.1.
   3. Incuber des PNJ à 37 °C pendant 48 à 96 h pour permettre aux PNJ de s’agréger et de former des neurosphères. Évaluez la taille de la sphère à l’aide d’une règle en direct sur un microscope à contraste de phase. Attendez que la plupart des sphères atteignent un diamètre approximatif de 100 μm (± 20 μm) (Figure 1). Les petites sphères se dispersent complètement et se brisent pendant l’essai de migration.
2. Préparation de plaques pour un essai de migration de la neurosphère
   1. Dissoudre les aliquotes de gel imitant la MEC dans 6 mL de milieu d’expansion à 30 %. Une fois la solution de gel d’imitation ECM/milieu d’expansion à 30 % préparée, ajoutez des véhicules, des facteurs de croissance ou des médicaments d’intérêt aux concentrations souhaitées.
      note: Les concentrations de véhicules, de médicaments et de facteurs de croissance doivent être augmentées pour tenir compte de l’ajout de 200 μL de neurosphères à la section 1.3.
   2. Plaquez 1 mL de gel mimique ECM / solution de milieu d’expansion à 30 % (± véhicules, facteurs de croissance ou médicaments) dans un puits d’une plaque à 6 puits. Faites 2 à 3 puits par condition expérimentale. Alternativement, des plats de 35 mm peuvent être utilisés. Incuber les plaques pendant au moins 30 min à 37 °C^.
      note: NE PAS aspirer la solution de gel d’imitation ECM/média d’expansion à 30 % pour ce dosage. Le placage de sphères sur un gel ECM-Mimic aspiré entraînera une migration rapide et excessive.
3. Placage des neurosphères
   1. Prélevez les neurosphères formées dans la section 1.1 et placez-les dans un tube conique. Lavez la vaisselle de 35 mm avec 1 ml de 1x PBS pour vous assurer que toutes les neurosphères sont collectées. Faites tourner les neurosphères collectées à 100 x g pendant 5 min.
   2. Remettez les neurosphères en suspension dans 1 à 3 ml de milieu d’expansion à 30 % préchauffé. Si 1 boîte de neurosphères est recueillie, 1 mL de milieu est utilisé pour remettre les sphères en suspension. Si 2 plats sont prélevés, 2 mL de milieu sont ajoutés pour remettre les sphères en suspension, etc. Pipeter doucement et utiliser uniquement un P-1000 pour s’assurer que les sphères ne sont pas brisées.
   3. Plaque de 200 μL des neurosphères remises en suspension dans la solution de gel mimétique ECM/30 % d’expansion réalisée en section 1.2. Plaques rocheuses dans toutes les directions pour répartir uniformément les neurosphères. Incuber les plaques pendant 48 h à 37°C.
   4. Retirez la solution de gel mimétique ECM/média d’expansion à 30 % et fixez les cellules dans 4 % de PFA, lavez et conservez les cellules dans 1 PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
4. Analyse des neurosphères
   1. Acquérez des images de neurosphères entières à l’aide des paramètres de contraste de phase à 10X. Assurez-vous que les sphères ne se touchent pas. Mesurez la migration moyenne à l’aide du logiciel ImageJ.
   2. Tracez le contour extérieur de la neurosphère à l’aide de l’outil à main levée. La ligne à main levée est accessible en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’icône de la ligne « droite ». Traçage manuel à l’aide d’une souris.
   3. Utilisez la fonction de mesure pour calculer l’aire de la trace. Assurez-vous que « zone » est sélectionné comme lecture dans la fenêtre « Définir les mesures » située sous l’onglet Analyser. Voir la figure 2 pour la trace du contour extérieur en bleu.
   4. Tracez la masse cellulaire interne de la sphère et mesurez l’aire. Voir la figure 2 pour la trace du contour intérieur en rouge. Quantifiez la migration moyenne en soustrayant la masse cellulaire interne de la surface totale de la neurosphère.
   5. Mesurez les neurosphères qui présentent une masse cellulaire interne densément tassée avec des cellules migrant vers l’extérieur sous la forme d’un tapis contigu (Figure 2).
   6. N’incluez pas de cellules à l’extérieur du tapis ou détachées de la neurosphère pour la mesure. Voir la figure 2 pour des exemples de cellules (entourées en blanc) qui sont exclues de la mesure du tapis extérieur. Analysez un minimum de 20 neurosphères pour chaque condition.

Résultats

Figure 1 : Sélection des neurosphères pour l’essai de migration. (A) Image en contraste de phase d’un champ représentatif de neurosphères à 24 h. Les sphères mesurent toutes moins de 100 μm et ne sont donc pas collectées pour le test de migration. (B) Image en contraste de phase d’un champ représentatif de neurosphères à 72 h. Toutes les sphères se situent dans la plage de 100 μm ± 20 μm, ce qui ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu neurobasal	ThermoFischer Scientific	21103049	Composant du NIM et du support d’expansion à 100 %
Milieu d’induction neuronale PSC : Protocole Lien : https://goo.gl/ euub7a	ThermoFischer Scientific	A1647801	Il s’agit d’un kit qui se compose d’un milieu neurobasal (NB) et d’un supplément d’induction neurale (NIS) 50x. Le NIS est utilisé pour fabriquer un milieu d’induction neuronale 1X et un milieu d’expansion à 100 %
DMEM/F12 Moyen avancé	ThermoFischer Scientific	Référence 12634-010	Composant du support d’expansion à 100 %
Matrigel qualifié hESC	Corning	354277	Gel mimique extracellulaire qualifié hESC (gel mimique ECM)
Plaques à 6 puits	Corning	COR-3506	Plaques de polystyrène utilisées pour la maintenance des NPC et pour les tests de migration de la neurosphère
FGF-2 de base humain	Peprotech	100 à 18 milliards	Facteur de croissance
Pénicilline/streptomycine	ThermoFischer Scientific	15140122	Antibiotique, composant du NIM, milieu d’expansion à 100 % et à 30 % d’expansion